質(zhì)粒提取原理及流程

質(zhì)粒提取原理及流程
 質(zhì)粒提取試劑盒簡介：
     質(zhì)粒(Plasmid)是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，大小從1-200kb不等，為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子，并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞中。質(zhì)粒主要存在于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中，它具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力，能在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù)，并表達(dá)所攜帶的遺傳信息。
 
質(zhì)粒提取原理及流程：
     較常用的質(zhì)粒DNA提取方法有3種：堿裂解法、煮沸法和去污劑(如Triton和SDS)裂解法。前兩種方法比較劇烈，適用于較小的質(zhì)粒(<15kb)。去污劑裂解法則比較溫和，一般用于分離大質(zhì)粒(>15kb)。堿裂解法是一種應(yīng)用為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法，其原理為：染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀分子；當(dāng)用堿處理DNA溶液時(shí)，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在回到中性時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象；變性染色體DNA的片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，離心去除沉淀后，就可從上清中回收質(zhì)粒DNA。目前，市面上質(zhì)粒提取試劑盒大多數(shù)都是采取上述的堿裂解方法，不同之處在于純化方式。目前比較常用的純化系統(tǒng)是硅基質(zhì)吸附材料，其原理為在高鹽環(huán)境下質(zhì)粒DNA能夠結(jié)合到硅基質(zhì)上，然后用低鹽緩沖液或水將質(zhì)粒DNA從硅基質(zhì)上洗脫下來。得到的質(zhì)粒可以用于酶切、PCR、測(cè)序、細(xì)菌轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
 
影響質(zhì)粒提取的因素：
     質(zhì)粒提取的得率和質(zhì)量與很多因素有關(guān)，如宿主菌的種類和培養(yǎng)條件、細(xì)胞的裂解、質(zhì)?？截悢?shù)、質(zhì)粒的穩(wěn)定性、抗生素、吸附柱的吸附量等。

宿主菌種類
     質(zhì)粒主要存在于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中，多數(shù)情況下我們是從大腸桿菌中提取質(zhì)粒。大腸桿菌的菌株不同會(huì)影響質(zhì)粒提取的質(zhì)量。從宿主菌如DH5α和*0中可以得到高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA。HBl01和它的衍生菌株，如TG1和JM系列會(huì)在裂解時(shí)產(chǎn)生大量的糖類，如果沒有*去除，將抑制后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的酶活性，影響質(zhì)粒DNA提取的質(zhì)量。另外，有些菌株有非常高的內(nèi)切酶活性，會(huì)降低DNA的得率。因此推薦使用DH5α和*0來提取質(zhì)粒DNA。
 
培養(yǎng)時(shí)間
    從固體培養(yǎng)基平板上挑取一個(gè)單菌落，接種到培養(yǎng)物中(含有相關(guān)抗生素的液體培養(yǎng)基中)，振蕩培養(yǎng)12-16小時(shí)。不應(yīng)超過16小時(shí)，因?yàn)檫@時(shí)細(xì)胞開始裂解，使得質(zhì)粒的得率降低，也會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒丟失或質(zhì)粒變異。
 
質(zhì)粒擴(kuò)增
    氯霉素能抑制宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和DNA的合成，但對(duì)松弛型質(zhì)粒的復(fù)制沒有影響。因此，在細(xì)菌培養(yǎng)液中加入氯霉素可提高松弛型質(zhì)粒的拷貝數(shù)。由于氯霉素抑制了宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和DNA的合成，從而抑制了染色體的復(fù)制，但質(zhì)粒復(fù)制所用的酶半衰期較長，故質(zhì)粒仍可繼續(xù)復(fù)制，這樣既可增加質(zhì)粒產(chǎn)量，又可降低細(xì)胞的數(shù)量，使細(xì)菌裂解液的粘度降低而便于操作。常用于擴(kuò)增的氯霉素濃度為170ug/ml 。
 
抗生素
    在菌株的各生長階段都應(yīng)加入抗生素篩選。現(xiàn)在用的許多質(zhì)粒都不含有在細(xì)胞分裂時(shí)確保平均分配的par位點(diǎn)，無質(zhì)粒的子細(xì)胞在無抗生素時(shí)復(fù)制速度遠(yuǎn)大于含質(zhì)粒的細(xì)胞。

幾種常用抗生素的濃度

質(zhì)?？截悢?shù): 
      質(zhì)?？截悢?shù)常用的定義是指生長在標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)基下每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中所含有的質(zhì)粒DNA分子的數(shù)目。每個(gè)細(xì)胞中的質(zhì)粒數(shù)主要決定于質(zhì)粒本身的起始復(fù)制機(jī)制。按照復(fù)制性質(zhì)，可以把質(zhì)粒分為兩類：一類是嚴(yán)緊型質(zhì)粒，當(dāng)細(xì)胞染色體復(fù)制一次時(shí)，質(zhì)粒也復(fù)制一次，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)只有1-2個(gè)質(zhì)粒，如F因子；另一類是松弛型質(zhì)粒，當(dāng)染色體復(fù)制停止后仍然能繼續(xù)復(fù)制，每一個(gè)細(xì)胞內(nèi)一般有20個(gè)左右質(zhì)粒，如ColEl質(zhì)粒。一般分子量較大的質(zhì)粒屬嚴(yán)緊型，分子量較小的質(zhì)粒屬松弛型。質(zhì)粒的復(fù)制有時(shí)和它們的宿主細(xì)胞有關(guān)，某些質(zhì)粒在大腸桿菌內(nèi)的復(fù)制屬嚴(yán)緊型，而在變形桿菌內(nèi)則屬松弛型。

部分質(zhì)粒的拷貝數(shù)

菌液收集及裂解
     細(xì)菌收集可以通過離心來進(jìn)行，不同的質(zhì)?？截悢?shù)，菌液量的需求不同，對(duì)于低拷貝的質(zhì)粒，要相應(yīng)增加菌液的量。菌液是在堿性環(huán)境下裂解的，由于不同的宿主菌細(xì)胞壁厚薄的差異，細(xì)胞的破壁程度不同， 對(duì)于細(xì)胞壁較厚的宿主菌， 先要進(jìn)行破壁處理：
革蘭氏陰性菌——不用特殊處理，堿裂解時(shí)就能有效破壁
革蘭氏陽性菌——溶菌酶處理
酵母和絲狀真菌——酵母破壁酶或玻璃珠
 
      菌液收集、重懸以及宿主菌細(xì)胞破壁后，細(xì)胞在含有RNase A的NaOH/SDS(溶液Ⅱ)中裂解。SDS溶解細(xì)胞膜的磷脂和蛋白成分，使細(xì)胞的內(nèi)容物如染色體、質(zhì)粒DNA和蛋白在堿性環(huán)境下變性。佳的裂解時(shí)間是質(zhì)粒大量釋放而沒有釋放染色體DNA的時(shí)間，盡量縮短質(zhì)粒暴露在變性環(huán)境中。長時(shí)間處在堿性環(huán)境中會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒發(fā)生不可恢復(fù)的變性。變性的質(zhì)粒在瓊脂糖膠上跑的較快，而且不能被限制性內(nèi)切酶消化。裂解產(chǎn)物在溶液Ⅲ中被調(diào)整到中性高鹽環(huán)境，高鹽使得變性的蛋白、染色體DNA、細(xì)胞碎片和SDS都沉淀下來，而質(zhì)粒復(fù)性留在上清溶液中。溶液要*混勻以確保沉淀*。為了防止染色體DNA污染質(zhì)粒DNA，要避免劇烈振蕩，以防止染色體DNA被打斷，造成對(duì)質(zhì)粒DNA的污染。因?yàn)槿旧wDNA的片段和質(zhì)粒DNA在高鹽條件下，都可以與硅膠膜結(jié)合，在低鹽的條件下，用洗脫液都能從膜上洗脫下來。因此，在裂解過程中要緩慢、輕柔顛倒離心管。

質(zhì)粒DNA分離和純化：
    純化要求
    質(zhì)粒DNA中不應(yīng)存在對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的酶活性有抑制作用的有機(jī)溶劑分子或過高濃度的金屬離子。避免其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖、脂類、基因組和RNA的污染。不同的后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)于質(zhì)粒純度的要求不同，常規(guī)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)(如酶切、測(cè)序等)普通純度的質(zhì)粒即可滿足實(shí)驗(yàn)，而對(duì)于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，要求質(zhì)粒的純度較高(如高純度或無內(nèi)毒素)?？梢赃x擇不同的質(zhì)粒提取試劑盒以滿足不同的實(shí)驗(yàn)要求。

純化方法
    用硅基質(zhì)材料吸附質(zhì)粒DNA來代替乙醇沉淀的純化方式，提取的質(zhì)粒純度高、操作方便快捷，可選擇的試劑盒有兩種類型，即普通質(zhì)粒提取試劑盒和無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒。
 
質(zhì)粒DNA的洗脫和收集
參見基因組DNA提取
 
質(zhì)粒的保存
    溶解在洗脫液TE中的質(zhì)粒DNA，也可以貯存在TE緩沖液中(用水溶解的質(zhì)粒只能短期保存，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室用的純水呈弱酸性，質(zhì)粒在酸性環(huán)境下會(huì)發(fā)生磷酸解)，4℃短期保存或-20℃和-70℃長期保存，也可在含有質(zhì)粒的細(xì)菌培養(yǎng)物中，加等體積甘油，于-70℃保存 。
 
質(zhì)粒鑒定與評(píng)價(jià)：
    瓊脂糖電泳檢測(cè)
    堿裂解法提取的質(zhì)粒經(jīng)瓊脂糖電泳進(jìn)行鑒定時(shí)，理想狀況是只出現(xiàn)超螺旋—條帶，但在質(zhì)粒提取過程中，由于機(jī)械力、酸堿度、試劑等原因，使質(zhì)粒DNA鏈發(fā)生斷裂，可能出現(xiàn)兩條帶或者出現(xiàn)三條帶，這三條帶電泳遷移率從快到慢，分別是超螺旋、開環(huán)和復(fù)制中間體(即沒有復(fù)制*的兩個(gè)質(zhì)粒粘連在—起)。如果加溶液Ⅱ后過度振蕩，會(huì)在遠(yuǎn)離這三條帶的位置出現(xiàn)條帶，這條帶泳動(dòng)得較慢，是大腸桿菌基因組DNA的片斷。非常偶然的是，有時(shí)候提取的質(zhì)粒會(huì)出現(xiàn)4個(gè)以上的條帶，這是由于特殊的DNA序列導(dǎo)致了不同程度的超螺旋(超螺旋的圈數(shù)不同)所致。但是，只要質(zhì)粒經(jīng)單酶切鑒定后，只有單一條帶，就證明沒有基因組的污染。
 
酶切檢測(cè)
    質(zhì)粒提取后，為了進(jìn)—步鑒定質(zhì)粒的正確與否，就要進(jìn)行酶切鑒定，通過與Marker對(duì)比，確定質(zhì)粒的分子量大小。
用紫外線分光光度計(jì)檢測(cè)濃度測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)為：OD 260 值為1相當(dāng)于大約50ug/ml雙鏈DNA。OD 260 /OD 280 比值在1.7-1.9之間說明所得DNA純度較好。OD 260 /OD 280 比值若低于1.7說明可能有蛋白污染。OD 260 /OD 280 比值若高于2.0則說明DNA有可能已降解。如果洗脫時(shí)不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水，比值會(huì)偏低，因?yàn)閜H值和離子濃度會(huì)影響光吸收值，但并不表示純度低。