RNA提取詳解

RNA提取
RNA提取試劑盒簡介：
    RNA是一種重要的遺傳信息分子，因此完整RNA的提取和純化，是進(jìn)行Northern雜交、RT-PCR、定量PCR等RNA相關(guān)研究的重要前提。
 
RNA提取的原理與方法：
    細(xì)胞中的RNA可以分為信使RNA、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA和核糖體RNA三大類，這三類RNA都存在于細(xì)胞質(zhì)中,因此不同組織總RNA提取的實(shí)質(zhì)就是將細(xì)胞裂解，釋放出RNA，并通過不同方式去除蛋白、DNA等雜質(zhì)，終獲得高純RNA產(chǎn)物的過程。

RNA提取流程
 
一、樣品處理
     從各種不同來源樣品(如細(xì)菌、酵母、血液、動(dòng)物組織、植物組織和培養(yǎng)細(xì)胞)，或同一來源樣品的不同組織(如植物幼嫩葉片、成熟根、莖等)中提取高質(zhì)量的RNA，因細(xì)胞結(jié)構(gòu)及所含的成分不同，樣品預(yù)處理的方式也各有差異。針對(duì)常用的提取材料，下面簡單介紹常規(guī)樣品預(yù)處理方法，若想了解具體操作步驟，請(qǐng)參照各類型樣品RNA提取操作步驟。
 
提取樣品的要求
     好使用新鮮樣品或取樣后立即在低溫(-20℃或-70℃)冷凍保存的樣品， 避免反復(fù)凍融，因?yàn)檫@會(huì)導(dǎo)致提取的RNA降解和提取量下降。

樣品預(yù)處理方式
植物材料——液氮研磨
動(dòng)物材料——勻漿、液氮研磨
培養(yǎng)細(xì)胞——蛋白酶K處理
細(xì)菌——溶菌酶破壁
酵母——酵母破壁酶或玻璃珠處理
 
二、細(xì)胞裂解
 
異硫氰酸胍/苯酚法
    異硫氰酸胍/苯酚法是一種傳統(tǒng)的RNA提取方法，適用于大部分動(dòng)植物材料，但對(duì)于次生代謝產(chǎn)物較多的植物材料提取RNA效果較差。異硫氰酸胍能使核蛋白復(fù)合體解離，并將RNA釋放到溶液中，采用酸性酚/混合液抽提，低pH值的酚將使RNA進(jìn)入水相，而蛋白質(zhì)和DNA仍留在有機(jī)相，從而可以完成RNA的提取工作。
 
    Solarbio公司的TRIquick和總RNA提取試劑盒就是基于異硫氰酸胍/苯酚法開發(fā)的一種總RNA提取試劑和試劑盒。TRIquick法應(yīng)用非常廣泛，適用于包括動(dòng)物組織、微生物材料、培養(yǎng)細(xì)胞等在內(nèi)的各類動(dòng)物性材料，同時(shí)還適用于次生代謝物較少的植物性材料，如幼苗、幼葉等。而總RNA提取試劑盒法主要應(yīng)用在動(dòng)物組織和培養(yǎng)細(xì)胞的RNA提取中，這種方法采用吸附性材料來純化RNA，因此與TRIquick法相比，總RNA提取試劑盒提取RNA具有純度更高的特點(diǎn)。
 
胍鹽/β-巰基乙醇法
   適用于各種不同動(dòng)物材料和次生代謝物少的植物材料。在這種方法中，胍鹽使細(xì)胞充分裂解，β-巰基乙醇作為蛋白的變性劑在實(shí)驗(yàn)全程中可以抑制RNase的活性，保護(hù)RNA不被降解。

三、RNA純化及獲得
純化要求
    RNA樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶(如逆轉(zhuǎn)錄酶)有抑制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子。避免其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染。排除DNA分子的污染。

純化方法及沉淀
 
1、有機(jī)溶劑抽提法
     抽提：在使用RNA提取試劑進(jìn)行RNA提取時(shí)，常使用進(jìn)行抽提，以去除蔗糖、蛋白等雜質(zhì)，并促進(jìn)水相與有機(jī)相的分離，從而達(dá)到純化RNA的目的。沉淀：抽提RNA后，一般采用異丙醇或乙醇來沉淀水相RNA。加入0.6倍水相體積的異丙醇或與水相等體積的異丙醇，室溫沉淀20-30分鐘，高速離心，可獲得RNA沉淀。
     洗滌沉淀：加入無RNase的75％乙醇，將RNA沉淀振蕩懸浮，使RNA沉淀中的鹽離子被充分溶解。然后再離心10-30分鐘，再次沉淀RNA。離心后，小心倒掉上清(注意不要倒出RNA沉淀)，隨后快速離心1-2秒，將殘留在管壁上的乙醇收集到管底后，用小槍頭吸凈，超凈臺(tái)中風(fēng)干1-2分鐘(注意不要晾得太干，否則RNA沉淀不易溶解)。
    溶解沉淀：加入適量的RNase-free ddH 2 O溶解RNA沉淀。
 
2、硅基質(zhì)吸附法
    隨著實(shí)驗(yàn)方法的改進(jìn)，現(xiàn)已發(fā)展出一種采用吸附材料純化核酸的方法。目前較常見的有：硅基質(zhì)吸附材料、陰離子交換樹脂和磁珠等。硅基質(zhì)吸附材料因其具有可特異吸附核酸，使用方便、快捷，不使用有毒溶劑如苯酚等優(yōu)點(diǎn)，成為核酸純化的。
     Solarbio公司總RNA提取試劑盒就是采用硅基質(zhì)吸附達(dá)到RNA分離純化目的。通過專一結(jié)合RNA的離心吸附柱和*的緩沖液系統(tǒng)，使樣品在高鹽條件下與硅膠膜特異結(jié)合，而蛋白、有機(jī)溶劑等雜質(zhì)不能結(jié)合到膜上而被洗脫，鹽類則被含有乙醇的漂洗液洗滌，后用RNase-free ddH 2 O將RNA從硅膠膜上洗脫下來。
 
一些特殊組織的RNA提取
    纖維組織：心臟/骨骼肌等纖維組織提取RNA的關(guān)鍵在于*破碎組織。這些組織細(xì)胞密度低，單位重量的組織中RNA含量較低，建議增加起始量。此外，一定要在液氮中將組織*磨碎。蛋白/脂肪含量高的組織：腦或植物脂肪含量高，酚抽提后，上清含白色絮狀物。必須用再次對(duì)上清進(jìn)行抽提。
    核酸RNase含量高的組織：脾、胸腺等組織的核酸和RNase含量很高。在液氮中研磨，再快速勻漿，能有效滅活RNase，如加入裂解液后過于粘稠，酚抽提不能有效分層，則加入更多裂解液可以解決此問題。多次酚抽提可以去除更多殘留的DNA。如果加入乙醇后馬上有白色沉淀形成，表明可能有DNA污染，可以在核酸溶解后用酸性酚再次抽提或者用DNaseI消化，去除DNA污染，植物組織和真菌組織：植物組織和真菌組織比動(dòng)物組織更為復(fù)雜，一般選擇在液氮條件下對(duì)樣品進(jìn)行研磨，以避免內(nèi)源RNase降解RNA。如果RNA降解問題不能解決，大多數(shù)情況下是樣品中含有的雜質(zhì)所致。許多植物和真菌中所含雜質(zhì)如多糖、多酚等都會(huì)殘留，因?yàn)檫@些雜質(zhì)分子與RNA有一些相似性，可與RNA同時(shí)沉淀或者吸附，因此在植物和真菌組織的提取中，需要用一些特別的步驟或者特別的試劑來去除多糖多酚等雜質(zhì)的干擾和污染。
 
四、RNA評(píng)價(jià)與鑒定
    提取得到RNA溶液后，我們需要對(duì)RNA進(jìn)行相關(guān)的質(zhì)量檢測，以確定它是否符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。RNA用于不同的后續(xù)實(shí)驗(yàn)，對(duì)其質(zhì)量要求不盡相同。cDNA文庫構(gòu)建要求RNA完整且無酶等抑制物殘留；Northern blot實(shí)驗(yàn)對(duì)RNA完整性要求較高，對(duì)酶反應(yīng)抑制物殘留要求較低；RT-PCR實(shí)驗(yàn)對(duì)RNA完整性要求不太高，但對(duì)酶反應(yīng)抑制物殘留要求嚴(yán)格。因此在進(jìn)行不同的實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)選擇不同的方法純化RNA，以達(dá)到佳的實(shí)驗(yàn)效果。
 
RNA得率檢測——分光光度計(jì)法
    RNA得率有很強(qiáng)的組織特異性，不同組織RNA的豐度和RNA提取的難易程度共同決定了該種組織的RNA得率。一般來說，可通過分光光度計(jì)測定RNA溶液在260nm處的吸光值來計(jì)算RNA的含量。RNA溶液在260、320、230、280nm下的吸光度分別代表了核酸、溶液渾濁度、雜質(zhì)(多肽、苯酚等)濃度和蛋白等有機(jī)物的吸收值。用標(biāo)準(zhǔn)樣品測得在波長260nm處，1μg/ml RNA鈉鹽吸光度為0.025(光程為1cm)，即OD 260 =1時(shí)，樣品中RNA濃度為40μg/ml。通常分光光度計(jì)OD 260 的讀數(shù)要介于0.15-1.0之間才是可靠的，因此RNA提取結(jié)束后，要根據(jù)大概產(chǎn)量稀釋到適當(dāng)濃度范圍，再用分光光度計(jì)檢測。

按下面的公式計(jì)算總RNA濃度：
    總RNA濃度(μg/ml)= OD 260 ×稀釋倍數(shù)× 40μg/ml
 
RNA純度檢測——分光光度計(jì)法
通過OD 260/280 來檢測RNA純度，OD 260/280 作為參考值。
OD 260/280 在1.9-2.1之間，可以認(rèn)為RNA的純度較好；
OD 260/280 值小于1.8，則表明蛋白雜質(zhì)較多；
OD 260/280 值大于2.2，則表明RNA已經(jīng)降解；
OD 260/280 值小于2.0，則表明裂解液中有異硫氰酸胍和β-巰基乙醇?xì)埩簟?br />注意：如果用TE溶解或洗脫RNA，會(huì)使OD 260/280 值偏大。
 
RNA完整性鑒定——瓊脂糖凝膠電泳
變性電泳：
我們可以通過RNA變性電泳，來鑒定RNA的完整性，但一般情況下常規(guī)電泳檢測即可。
 
RNA變性電泳方法如下：
1、凝膠制備：1.2％瓊脂糖凝膠
2、上樣電泳
①電泳混合液的制備：
10×甲醛變性電泳緩沖液 1.25ul
37％甲醛 2.2ul
甲酰胺 6.25ul
②加入RNA
③混合后1000-2000rpm離心5-10秒
④55℃加熱15分鐘
⑤加入2.5 μl甲醛凝膠上樣緩沖液，混合后離心5秒
⑥將樣品加入點(diǎn)樣孔
⑦在5 V/cm的電壓下電泳溴酚藍(lán)帶跑到電泳槽中央(20cm長電泳槽，95V電壓，1小時(shí)左右)。
rRNA占總RNA的80-85％，在瓊脂糖凝膠上可以清晰地看到28S(23S)和18S(16S)rRNA。如28S rRNA的量約為18S rRNA的兩倍，說明RNA完整性較好。
 
常規(guī)電泳：
    由于變性電泳操作步驟較為復(fù)雜，所以在要求不太嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)中，RNA的檢測可以通過常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行。一般1％左右的凝膠就可以。按常規(guī)電泳配制好凝膠和電泳溶液，總RNA在普通瓊脂糖凝膠電泳上顯示條帶與變性電泳一致。
 
五、RNA的保護(hù)
    與DNA提取實(shí)驗(yàn)相比，RNA的提取實(shí)驗(yàn)常常較為困難，這主要是由于RNA非常容易降解。而造成RNA降解的原因來自內(nèi)因和外因兩個(gè)方面。內(nèi)因：RNA核糖殘基的2’和3’位置帶有羥基，易被水解；外因：生物體內(nèi)和外部環(huán)境中存在大量RNase，并且RNase不易失活，高溫后仍然能夠正確折疊恢復(fù)活性。因此， 從樣品的儲(chǔ)存、 RNA的提取以及RNA提取完成后的保存， 我們都需要格外小心， 處處防范RNase對(duì)RNA的降解作用。 下面， 我們將介紹RNA提取過程中保護(hù)RNA的措施。
 
1、提取前的RNA保護(hù)
     材料樣品中的RNA保護(hù)：一般而言，在收集材料樣品準(zhǔn)備提取RNA時(shí)，我們先應(yīng)該選擇新鮮的材料，取樣后迅速液氮研磨或勻漿處理，以保證我們所要提取材料中的RNA本身是完整的。如果收集好材料后，不能馬上進(jìn)行RNA的提取工作，就需要先將材料保存好，冰凍材料保證低溫儲(chǔ)存，防止反復(fù)凍融，以保證材料中的RNA在保存過程中不被降解。液氮低溫保存法是一種常用的保存方法。先將材料在液氮中速凍后保存于-70℃冰箱或直接保存在液氮中。
 
     實(shí)驗(yàn)室中RNA提取工作區(qū)RNase的清除：自然界中的RNase含量非常豐富，在空氣中會(huì)有許多RNase存在。因此，在RNA提取實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該辟出RNA提取專區(qū)，該區(qū)域要進(jìn)行RNase的清除處理，同時(shí)要注意避免同其它實(shí)驗(yàn)區(qū)發(fā)生交叉污染。
 
實(shí)驗(yàn)耗材、玻璃器皿上的RNase的清除：
     所有提取RNA要用到的耗材和器皿都要進(jìn)行RNase清除處理。使用無RNase的塑料制品、槍頭、移液器、電泳槽等避免交叉污染，實(shí)驗(yàn)臺(tái)面等要*處理。RNA處在TRIquick試劑中是不會(huì)被RNase降解的，但提取后的繼續(xù)處理過程中應(yīng)使用不含RNase的塑料或玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小時(shí)以上，塑料器皿可用DEPC處理后再高壓滅菌，即可去除RNase。實(shí)驗(yàn)所用的試劑或溶液，必須確保無RNase。 配制溶液應(yīng)使用無RNase的水。
 
2、提取過程中的RNA保護(hù)
     組織破碎過程中的RNA保護(hù)：選擇合適的勻漿方法，盡可能減少勻漿的時(shí)間，保持低溫勻漿。在進(jìn)行細(xì)胞裂解之前，一般要先將組織塊破碎。破碎所采用的方法主要有液氮研磨或勻漿處理。液氮研磨時(shí)注意不要讓液氮揮發(fā)干凈，因?yàn)橐旱梢猿浞忠种芌Nase，一旦液氮揮發(fā)干凈，就可能造成內(nèi)源RNase對(duì)RNA的降解作用。
     細(xì)胞裂解過程中的RNA保護(hù)：選擇合適的裂解液，裂解液的量要足夠，裂解要充分。在裂解液加量一定的情況下，所加入的提取材料的量就應(yīng)該按說明書中的比例加入，如果材料太多，會(huì)造成裂解不充分和RNase抑制不充分的雙重后果，從而使RNA的得率、完整性和純度都受到破壞。
 
     實(shí)驗(yàn)人員的注意事項(xiàng)：在提取RNA的過程中，實(shí)驗(yàn)操作者本身也應(yīng)該注意相關(guān)問題。因?yàn)槲覀兊氖稚稀⑼僖褐卸紩?huì)有大量的RNase存在， 所以在進(jìn)行RNA提取實(shí)驗(yàn)時(shí)， 應(yīng)該戴上口罩，并及時(shí)更換手套。這不僅是對(duì)RNA的保護(hù)措施， 同的也是對(duì)實(shí)驗(yàn)操作者自身的保護(hù)。

3、保存過程中的RNA保護(hù)
     在經(jīng)過從材料采集到RNA提取等一系列精心地準(zhǔn)備和實(shí)驗(yàn)之后，我們終于得到了高質(zhì)量的RNA，那么接下來的RNA保存就成為重點(diǎn)問題，而其中關(guān)鍵的問題就是如何避免保存過程中的RNA降解。
RNAwait就是在RNA保存過程中常用的一種RNase抑制劑，它能夠去除溶液中可能存在的RNase污染，保證RNA完整性不受破壞。
 
4、后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的RNA保護(hù)
     RNA的提取歸根到底只是一個(gè)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，這就意味著我們還要用RNA來完成許多后續(xù)實(shí)驗(yàn)，例如：RT-PCR，Northern blot，體外轉(zhuǎn)錄和翻譯等。 那么在這些后續(xù)實(shí)驗(yàn)中， 也需要對(duì)RNA進(jìn)行持續(xù)的保護(hù)， RNasin就是在這類后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用廣泛的RNase抑制劑。

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