感受態(tài)細胞相關問題

如何選擇合適的宿主菌：

1、所選的宿主菌株應對所用質粒的抗生素抗性基因敏感。

2、如進行藍/白斑篩選，宿主菌β-半乳糖苷酶的α-肽編碼區(qū)應在染色體或附加體上缺失掉( lac Z Δ Μ15)。*0和DH5α

都能用于藍/白斑篩選。

3、要表達重組蛋白，可使用帶有可誘導的T7 RNA聚合酶基因的菌株，如BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS。

4、使用pGEM載體克隆大片段時(>7-8 kb)，經轉化的菌株在30℃而不是在37℃生長，更有利于復蘇。作簡單的亞克隆連接實驗，亞克隆轉化效率的感受態(tài)細胞就可滿足克隆需要，更高轉化效率的感受態(tài)細胞可用于作比較困難的克隆實驗。為提高獲得目的克隆的機會，應用盡可能高轉化效率的感受態(tài)細胞(>10 8 cfu/μg DNA)。

如何篩選重組菌落：

1、可使用藍/白斑篩選法，在涂布有IPTG和X-Gal的篩選平板上，重組菌株為白色，未轉入重組質粒的菌株為藍色。

2、可對小量提取的質粒DNA做限制性酶切，采用Solarbio公司的質粒提取試劑盒，可快速提取多個樣本，而且由于提取的質粒純度高，不會有酶切切不開影響實驗的情況。

3、也可直接用細菌菌落進行PCR反應，篩選存在目的片段的重組菌落。Solarbio公司生產的PCR反應系統(tǒng)(MasterMix系列產品)特別適合這種方法。用滅菌的吸頭挑取單個菌落到已加入MasterMix的PCR管中，加入特異引物，進行PCR擴增。擴增反應前在94℃變性5分鐘，有利于細菌的裂解，提高PCR產物擴增的成功率。將所得PCR產物在瓊脂糖凝膠上檢測擴增帶。

4、另一種篩選重組菌落的方法是用插入片段特異引物進行菌落雜交。菌落生長后轉移到固體支持物如硝酸纖維膜上，作原位裂解，使質粒附著到膜上，然后用核酸引物作雜交。多用于篩選稀有克隆菌落。

如何檢測感受態(tài)細胞的效價：

為確定感受態(tài)細胞的轉化效率，可將一定量的超螺旋質粒轉化到感受態(tài)細胞中，取一部分轉化的細菌，涂布到選擇培養(yǎng)基上，可用菌落生長單位/μg DNA，按下面的方法計算感受態(tài)細胞的轉化效率。

計算公式：轉化效率＝產生菌落的總數/鋪板DNA的總量

例如：取1μl(0.1 ng/μl)超螺旋質粒轉化100μl的感受態(tài)細胞。

向轉化反應液中加入900μl培養(yǎng)液，讓細菌恢復一小段時間，取100μl鋪板，培養(yǎng)，產生1000個菌落。

轉化0.1 ng DNA，用SOC稀釋到1000μl后，取1/10涂平板，則涂平板共用0.01 ng質粒DNA，所以轉化率＝1000克隆/0.01 ng DNA

=10 5 cfu/ng=10 8 cfu/μg。

轉化效率1×10 6 cfu/μg DNA可滿足普通的亞克隆實驗；1×10 7cfu/μg DNA用于作更復雜的亞克隆，有*的DNA的轉化，T-克隆實驗；構建文庫和突變要求用的轉化的效率為>1×10 8 cfu/μg DNA。