植物蛋白質(zhì)提取方法總匯

植物蛋白質(zhì)提取方法總匯
    植物蛋白是蛋白質(zhì)的一種，來源是從植物里提取的，營(yíng)養(yǎng)與動(dòng)物蛋白相仿，但是更易于消化。含植物蛋白豐富的是大豆。但在飲食中，植物蛋白和動(dòng)物蛋白要搭配食用。植物蛋白盡管一般不如動(dòng)物蛋白好，但仍是人類膳食蛋白質(zhì)的重要來源。谷類一般含蛋白質(zhì)6%-10%，不過其中必需氨基酸種或多種含量低（限制氨基酸）。薯類含蛋白質(zhì)2%-3%。某些堅(jiān)果類如花生、核桃、杏仁和蓮子等則含有較高的蛋白質(zhì)（15%-30%）。豆科植物如某些干豆類的蛋白質(zhì)含量可高達(dá)40%左右。特別是大豆在豆類中更為突出。它不僅蛋白質(zhì)含量高，而且質(zhì)量亦高，是人類食物蛋白質(zhì)的良好來源。植物蛋白為素食者飲食中主要的蛋白質(zhì)來源，可用以制成形、味、口感等與相應(yīng)動(dòng)物食品相似的仿肉制品。素食者專食不*蛋白質(zhì)，會(huì)發(fā)生營(yíng)養(yǎng)缺乏癥，必須兼食大豆蛋白質(zhì)。 
    植物蛋白是主要來源于米面類、豆類，但是米面類和豆類的蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值不同。米面類來源的蛋白質(zhì)中缺少賴氨酸（一種必需氨基酸），因此其氨基酸評(píng)分較低，僅為0.3～0.5，這類蛋白質(zhì)被人體吸收和利用的程度也會(huì)差些。

一、植物組織蛋白質(zhì)提取方法 
1、根據(jù)樣品重量（1g樣品加入3.5ml提取液,可根據(jù)材料不同適當(dāng)加入）,準(zhǔn)備提取液放在冰上.
2、把樣品放在研缽中用液氮研磨,研磨后加入提取液中在冰上靜置（3-4小時(shí)）.
3、用離心機(jī)離心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃
4、提取上清液,樣品制備完成.
蛋白質(zhì)提取液：300ml
1、索萊寶T1150 1M Tris-HCl(pH=8.0)  45ml
2、索萊寶G8190 甘油（Glycerol）75ml
3、索萊寶P8290 PVP40000  聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g
這種方法針對(duì)SDS-PAGE,垂直板電泳!

二、植物組織蛋白質(zhì)提取方法 
氯醋酸—丙酮沉淀法
1、在液氮中研磨葉片
2、加入樣品體積3倍的提取液在-20℃的條件下過一夜,然后離心（4℃8000rpm以上1小時(shí)）棄上清.
3、加入等體積的冰浴丙酮（含0.07%的β-巰基乙醇）,搖勻后離心（4℃8000rpm以上1小時(shí)）,然后真空干燥沉淀,備用.
4、上樣前加入裂解液,室溫放置30分鐘,使蛋白充分溶于裂解液中,然后離心（15℃8000rpm以上1小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間以沒有沉淀為標(biāo)準(zhǔn)）,可臨時(shí)保存在4℃待用.
5、用索萊寶PC0020 BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒法定量蛋白,然后可分裝放入-80℃?zhèn)溆?
藥品：提取液：含10%TCA和0.07%的β-巰基乙醇的丙酮.裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml滅菌的去離子水中（終體積為5ml）,使用前再加入1M的DTT65ul/ml.
這種方法針對(duì)雙向電泳,雜質(zhì)少,離子濃度小的特點(diǎn)!當(dāng)然單向電泳也同樣適用,只是電泳的條帶會(huì)減少!

三、組織：腸黏膜 
目的：WESTERN BLOT檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)
應(yīng)用TRIPURE提取蛋白質(zhì)步驟：
含蛋白質(zhì)上清液中加入異丙醇：（1.5ml每1mlTRIPURE用量）
倒轉(zhuǎn)混勻,置室溫10min
離心：12000 g,10min,4度,棄上清
加入0.3M鹽酸胍（G8070 Guanidine HCl   鹽酸胍）/95％乙醇：（2ml每1mlTRIPURE用量）
振蕩,置室溫20min
離心：7500g,5 min,4度,棄上清
重復(fù)0.3M鹽酸胍/95％乙醇步2次
沉淀中加入100％乙醇 2ml
充分振蕩混勻,置室溫20 min
離心：7500g,5min,4度,棄上清吹干沉淀
1％SDS溶解沉淀
離心：10000g,10min,4度
取上清-20度保存（或可直接用于WESTERN BLOT）
存在的問題：加入1％SDS后沉淀不溶解,還是很大的一塊,4度離心后又多了白色沉定,SDS結(jié)晶?測(cè)濃度,含量才1mg/ml左右.
解決：提蛋白試劑盒,另外組織大小適中,要碎,立即加2X BUFFER,然后煮5－10分鐘,效果很好的.

四、植物材料：水稻苗,葉鞘,根
1、200毫克樣品置于冰上磨碎
2、加lysis buffer,離心,10000rpm,4度,5min取上清
3、重復(fù)離心5min
lysis buffer：urea np-40 ampholine 2-me pvp-40

五、蛋白質(zhì)樣品制備
秧苗蛋白質(zhì)樣品的提取按Davermal等（1986）的方法進(jìn)行.
100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂,用液氮研磨成粉,加入1.5 ml 10% 三氯乙酸（索萊寶T8100 Trichloroacetic acid,minimum 99.0% titration 三氯乙酸）（丙酮配制,含10mM即0.07%β-巰基乙醇）,混勻,-20℃沉淀1小時(shí),4℃,15000 r/min離心15 min,棄上清,沉淀復(fù)溶于1.5ml冷丙酮(含10 mMβ-巰基乙醇),再于-20℃沉淀1小時(shí),同上離心棄上清,（有必要再用80％丙酮(含10 mMβ-巰基乙醇所得沉淀低溫冷凍真空抽干.
按每mg干粉加入20μl（可調(diào)） UKS液[9.5 M尿素,5mM碳酸鉀,1.25%SDS,0.5%DTT(二硫蘇糖醇),2% Ampholine (Amersham Biotech Inc,pH3.5-10),6% Triton X-100],37℃溫育30min,期間攪動(dòng)幾次,28度 （溫度低,高濃度的尿素會(huì)讓溶液結(jié)冰）16000 r/min離心15 min,離心力越大時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn)越好!上清即可上樣電泳.或者-70度保存

六、植物根中蛋白質(zhì)的抽取
(1) sample,液氮研磨
(2) 裝1.5 ml centrifuge 用tube
(3) 加 1M KH2PO4 K2HPO4 700 ul
(4) 12000 rpm,4度,10-15minite
(5) 取上層液,蛋白質(zhì)就在里面