膜再生液的配制方法以及注意事項(xiàng)

膜再生液可在不影響抗原蛋白的情況下清除膜上結(jié)合的抗體。隨后，可以使用不同的抗體進(jìn)行下一輪Western Blot實(shí)驗(yàn)。一般stripping的原理都是利用蛋白變性以及利用beta-mercaptoethanol打開-s-s-，使一抗二抗解聚變性而被洗去，但洗脫的強(qiáng)度是一個(gè)關(guān)鍵，小了抗體洗不干凈影響re-probe，大了又造成抗原的損失。

膜再生液的配制：

方法一：需要50℃溫?。?/span>

Stripping Buffer:β-mercaptoethanol 342 μl；20% SDS 5 ml；1MTris-Cl pH 6.7 3.125 ml；加ddH2O50 ml。

方法：將用過(guò)的膜浸入stripping buffer中，置50℃水浴箱中30min，間斷振搖。之后用TTBS洗5min/次洗到無(wú)beta-mercaptoethanol的味道就好。此時(shí)你已經(jīng)可以按新的轉(zhuǎn)移好的膜來(lái)再次使用了。

方法二:(僅適用PVDF，但這種方法抗原損失少，抗體洗脫也比較干凈，我們比較過(guò)后也一直在使用）

Stripping Buffer：50mM Glycine-NaOH(pH10.8), 7M Guanidine hydrochloride, 100mM KCl, 0.2mM EDTA, add 22.5uL beta-Mercaptoethanol/10mL stripping buffer just before use.

1) After ECL development, wash membrane once for 10min with TBST/PBST.

2) Incubate the membrane in stripping buffer in a shake for 6-8min at RT.

3) Washed stripped membrane at least 3x for 8min each with TBST/PBST, then re-block.

這種方法stripping buffer可以重復(fù)利用2次，用時(shí)也較快，當(dāng)然基于鹽酸胍的配方還有很多，附件中也附一篇使用鹽酸胍的文章，文中也比較了幾種stripping方法，希望對(duì)lz有幫助；

方法三：（實(shí)際上此法沒(méi)有洗去一二抗，但此法是理論上抗原無(wú)損失的）

也在附件中附上原文，原理就和IHC中封閉內(nèi)源過(guò)氧化物酶的道理是一樣的。

膜再生液的注意事項(xiàng)：

1. 膜再生液實(shí)質(zhì)是在不影響膜上結(jié)合的抗原的條件下將抗體洗脫下來(lái)， 實(shí)際操作中， 膜類型、 抗體類型、濃度及抗原特性都影響洗脫難易度。

2. 適用于 ECL 和類似的化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行的 Western 檢測(cè)。不適用于非化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行的 Western檢測(cè)，例如 DAB，NBT/BCIP。

3. 用 ECL 顯色后，再生液洗脫幾分鐘后，可再次加入 ECL 顯色液顯影，如膠片上顯示條帶，表明抗體未除凈，須進(jìn)一步在再生液中浸泡，膠片上無(wú)顯色。

4. 使用脫脂奶粉封閉的膜要比使用 BSA 封閉的膜更容易再生。

5. 盡量避免讓膜干燥。