一抗、二抗的選擇原理及方法

1. 一抗選擇要點(diǎn)
 

（1）確定抗體的名字，注意中英文名字、它名、亞型等信息。
 

（2）確定你的實(shí)驗(yàn)類(lèi)型，Elisa，WB，IHC，ICC，還是FACS。一般抗體的說(shuō)明書(shū)都會(huì)列出該抗體經(jīng)驗(yàn)證過(guò)適用于何種實(shí)驗(yàn)的類(lèi)型，如果抗體說(shuō)明 書(shū)沒(méi)有提及的應(yīng)用類(lèi)型，并不意味著該抗體不適用于此種分析應(yīng)用類(lèi)型，而僅是說(shuō)明尚未經(jīng)過(guò)此種實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，請(qǐng)根據(jù)說(shuō)明書(shū)列出的已驗(yàn)證的類(lèi)型來(lái)選擇適合你實(shí)驗(yàn)的 抗體。
 

（3）確定實(shí)驗(yàn)樣本的種屬，Human，Mouse，還是Rat。一般抗體說(shuō)明書(shū)都列出該抗體經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證過(guò)適用于何種物種實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)根據(jù)說(shuō)明書(shū)列出已驗(yàn)證的種屬來(lái)選擇適合你實(shí)驗(yàn)的抗體。
 

（4）樣本蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)。了解樣本蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)有助于選擇合適的抗體，待測(cè)樣本蛋白的結(jié)構(gòu)域和樣本在提取和處理過(guò)程中是否會(huì)變性，蛋白空間構(gòu)象的改變，會(huì)影響抗體的免疫親和反應(yīng)。
 

（5）單多克隆抗體的選擇。市面上的抗體還是以多克隆抗體為主，一般單克隆抗體特異性強(qiáng)，但親和力相對(duì)小，檢測(cè)抗原靈敏度相對(duì)就低；而多克隆抗體特異性稍弱，但抗體的親和力強(qiáng)，靈敏度高，但易出現(xiàn)非特異性染色（可以通過(guò)封閉等避免）。

2. 二抗選擇要點(diǎn)
 

（1）種屬來(lái)源。主要根據(jù)一抗種屬來(lái)源來(lái)決定購(gòu)買(mǎi)二抗來(lái)源，如一抗是小鼠來(lái)源，那二抗就買(mǎi)抗小鼠的即可（羊、兔等均可）。
 

（2）標(biāo)記物的選擇。有HRP、Biotin、熒光素等標(biāo)記物。一般SP三步法二抗選擇Biotin標(biāo)記的二抗，以與后面的SP結(jié)合反應(yīng)，而免疫熒光染色就需要購(gòu)買(mǎi)不同熒光素標(biāo)記的二抗，如羅丹明、FITC、Cy3等常用熒光素。

3.  一抗具體選擇分析

檢測(cè)任何目的靶蛋白都有不止一種抗體可供選擇，在同一個(gè)抗體公司，可能會(huì)有好幾種，甚好幾十種；在不同的抗體公司，那就更多了。那怎樣在琳瑯滿(mǎn)目的抗體中，選擇自己實(shí)驗(yàn)需要的抗體呢？主要考慮如下幾種因素：分析自己實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)方法是哪種？分析自己實(shí)驗(yàn)中標(biāo)本的種屬是哪種動(dòng)物或人的？分析樣本中的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，分析抗體的標(biāo)記和檢測(cè)，分析抗體的宿主來(lái)源種屬等等。

（1）分析自己實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)方法是哪種？
 

一般抗體說(shuō)明書(shū)都列出該抗體經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證過(guò)適用于何種分析類(lèi)型，如：可以應(yīng)用于WB、IHC、ICC、ELISA、FCM分析等。

如果抗體說(shuō)明書(shū)沒(méi)有提及的應(yīng)用類(lèi)型，并不意味著該抗體不適用于此種分析應(yīng)用類(lèi)型，而僅是說(shuō)明尚未經(jīng)過(guò)此種分析試驗(yàn)驗(yàn)證。為了避免實(shí)驗(yàn)風(fēng)險(xiǎn)，當(dāng)說(shuō)明書(shū)中沒(méi)有提及的應(yīng)用方法時(shí)，可向商家申請(qǐng)測(cè)試裝，進(jìn)行測(cè)試后，再?zèng)Q定是否購(gòu)買(mǎi)。

如果抗體不適用某些分析試驗(yàn)，則會(huì)在抗體說(shuō)明書(shū)上標(biāo)注出來(lái)不適于某分析試驗(yàn)。

（2）分析自己實(shí)驗(yàn)中標(biāo)本的種屬是哪種動(dòng)物或人的？
 

一般抗體說(shuō)明書(shū)都列出該抗體經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證過(guò)適用于何種動(dòng)物或人的標(biāo)本，如：可以用于rat、mouse、human、pig、goat等動(dòng)物的標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)。也就是說(shuō)應(yīng)選擇物種相同或有交叉反應(yīng)的抗體，抗體可能與不同物種的同種靶蛋白有交叉反應(yīng)，因其氨基酸序列同源性較高。
 

如果樣本的種類(lèi)未列入抗體說(shuō)明書(shū)上的交叉反應(yīng)種屬表中，并不意味著該抗體不適用于檢測(cè)該物種的蛋白，而只是表示該物種尚未用此抗體檢測(cè)驗(yàn)證過(guò)。為了避免實(shí)驗(yàn)風(fēng)險(xiǎn)，盡量不要使用說(shuō)明書(shū)中沒(méi)有提及的標(biāo)本的種屬的抗體。
 

或者通過(guò)序列比對(duì)的方法來(lái)預(yù)測(cè)交叉反應(yīng)，可應(yīng)用Expasy和NCBI BLAST來(lái)進(jìn)行不同物種蛋白同源性比對(duì)。如果比對(duì)結(jié)果，證明同源性比較高的，也可以選擇。

（3）分析樣本中的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)性質(zhì)
 

了解樣本蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)有助于選擇合適的抗體，少兩方面因素需要考慮：

待測(cè)樣本蛋白的結(jié)構(gòu)域：抗體是由各種不同免疫原免疫宿主而制備得來(lái)，其中的免疫原包括：全長(zhǎng)蛋白、蛋白片斷、多肽、全有機(jī)體（如：細(xì)菌）或細(xì)胞，抗體說(shuō)明書(shū)一般都有免疫原的描述，如果打算檢測(cè)的是蛋白片斷或一種特殊的同型物或蛋白全長(zhǎng)的某一區(qū)域，則必須選擇用含此片段域的免疫原制備出的抗體。如果打算用FCM流式檢測(cè)活細(xì)胞的表面蛋白，則需要選擇含該表面蛋白的胞外域來(lái)免疫制備的抗體。

樣本的提取或處理過(guò)程：某些抗體要求樣本經(jīng)過(guò)某些特殊處理，例如：許多抗體只識(shí)別還原和變性的、表位已暴露不受二級(jí)四級(jí)結(jié)構(gòu)阻礙的蛋白樣本，另一方面，某些抗體僅識(shí)別天然折疊狀態(tài)的蛋白。當(dāng)選擇免疫組化的抗體時(shí)，應(yīng)注意某些抗體只識(shí)別未固定的冷凍的組織，而另一些抗體則適用于無(wú)需抗原修復(fù)解交聯(lián)步聚的甲醛固定石蠟包埋的組織，這些都會(huì)在抗體說(shuō)明書(shū)上應(yīng)用部分標(biāo)示出來(lái)。

（4）抗體宿主物種的選擇
 

一般說(shuō)來(lái)，在使用偶聯(lián)二抗結(jié)合無(wú)偶聯(lián)物的一抗時(shí)，一抗宿主動(dòng)物的物種選擇較為重要，對(duì)于免疫組化而言，盡可能選擇與樣本不同種系物種的一抗，從而避免二抗與樣本內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)生交叉反應(yīng)，例如：檢測(cè)小鼠樣本蛋白，則不應(yīng)選擇小鼠或大鼠源的一抗，好選兔源的一抗，則二抗則可選擇偶聯(lián)了檢測(cè)分子（酶、熒光素、生物素等）的抗兔IgG。如果選擇有偶聯(lián)物的一抗則不適用上述情況，除免疫組化外的其它對(duì)不含內(nèi)源性免疫球蛋白樣本的檢測(cè)方法，則抗體宿主物種的影響不大，如對(duì)不含IgG的細(xì)胞裂解物樣本的western blotting檢測(cè)，盡管如此，含有血清的組織裂解物和組織培養(yǎng)上清中含有免疫球蛋白，還原變性樣本中含IgG，在western blot檢測(cè)中則結(jié)合出現(xiàn)IgG分子50 and 25 kDa的重鏈和輕鏈條帶。