人粒細(xì)胞無形體病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法

樣本采集對(duì)象
1. 人粒細(xì)胞無形體病病例（包括疑似病例，以下同）。
2. 病例密切接觸者或其他健康人群。
3. 疫源地可疑宿主動(dòng)物（野生動(dòng)物及狗、羊、牛等家畜）、媒介蜱。
標(biāo)本種類及采集方法
1. 抗凝血。
常用EDTA抗凝管或枸櫞酸鹽抗凝管采集血液5ml，用于病原分離。應(yīng)盡可能在病人使用抗生素前進(jìn)行血液的采集。
2.非抗凝血。
用無菌真空管，采集病例、健康人群及宿主動(dòng)物非抗凝血5ml，用于血清抗體及PCR檢測(cè)。采集后，應(yīng)及時(shí)分離血清，將血清、血球分別保存。急性期抗體及PCR檢測(cè)用血液采集盡可能在發(fā)病后1周內(nèi)，恢復(fù)期抗體檢測(cè)標(biāo)本采集少間隔2-3周。如第2份血清在1個(gè)月之內(nèi)抗體升高不明顯的，應(yīng)建議間隔2-4周后采集第3份血液標(biāo)本。
3.包涵體檢測(cè)血涂片的制備。采集血液標(biāo)本后，制作厚血片，進(jìn)行紅細(xì)胞裂解處理等。
4.媒介蜱標(biāo)本的采集。
采集動(dòng)物體表媒介蜱，用鑷子夾取，放入鋪墊有潮濕濾紙或紗布的青霉素小瓶或試管中，用紗布包緊瓶口以防止蜱爬出。實(shí)驗(yàn)室接到蜱標(biāo)本后，先應(yīng)進(jìn)行種屬鑒定，然后按類別分組（1-5只蜱/組），采用75%酒精浸泡30min后，用無菌蒸餾水反復(fù)沖洗3次。后進(jìn)行分組研磨，研磨液用于提取DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
5.有條件時(shí)，可采集活檢或尸檢標(biāo)本，冰凍、福爾馬林固定或石蠟包埋后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。具體方法參照病理實(shí)驗(yàn)室相關(guān)要求和衛(wèi)生部《傳染病人或疑似傳染病人尸體解剖查驗(yàn)規(guī)定》的相關(guān)要求。
人粒細(xì)胞無形體病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)
（一）包涵體的檢測(cè)。
1. 血片及白細(xì)胞涂片制備
采集的抗凝血標(biāo)本盡快用血球?qū)油蒲稍锖罄浔潭?0min；或提取抗凝血中的白細(xì)胞并進(jìn)行涂片，待干燥后冷丙酮固定10min。
2. 染色
通常采用瑞氏（Wright）染色法、姬氏（Giemsa）染色法及瑞－姬混合染色法。有條件的實(shí)驗(yàn)室，可使用美國CDC推薦的染色方法。
3. 染液配置方法
（1）瑞－姬染液：取瑞氏染料和姬氏染料各0.5 g，以甲醇研溶，加甲醇500ml保存，每天搖勻１次，１周后可使用。
（2）改良Mc Donald法瑞－姬染色劑：75 ml甘油（分析純）中加入磷酸鹽緩沖液（Na2HPO4 1g和KH2PO4 2g），以4 ml蒸餾水溶解，37 ℃水浴24 h溶解混勻，用濾紙過濾，保存于密封的棕色瓶中備用。上述甘油緩沖液1.5 ml加瑞－姬染色劑50 ml，混勻后備用。
4. 染色步驟
血推片或白細(xì)胞涂片分別以兩種染色劑染色2 min，再加蒸餾水作用5 min，用自來水沖洗。
5. 結(jié)果觀察
中性粒細(xì)胞中可見桑葚狀包涵體（見圖1），并注意保存相關(guān)標(biāo)本，以便進(jìn)行復(fù)核。
（二）血清學(xué)檢測(cè)。
常用血清學(xué)方法為間接免疫熒光（IFA）法。采集急性期（發(fā)熱初期，一般發(fā)病1周內(nèi)）與恢復(fù)期（少間隔2-3周）雙份血清。如恢復(fù)期血清抗體檢測(cè)陰性，應(yīng)建議醫(yī)生采集第3份血液樣本（間隔2-4周）。
1. 試劑
使用推薦的、經(jīng)過ISO質(zhì)量認(rèn)證的產(chǎn)品。
2. 方法及操作按說明書進(jìn)行。
3. 結(jié)果解釋
IFA檢測(cè)結(jié)果解釋按說明書進(jìn)行。
如果同時(shí)檢測(cè)雙份血清，IgG抗體4倍升高，則結(jié)果強(qiáng)烈支持嗜吞噬細(xì)胞無形體感染。如果急性期抗體升高，而恢復(fù)期沒有升高或輕微升高，則應(yīng)采集第3份血液樣本（間隔2-4周）進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)。
（三）嗜粒細(xì)胞無形體核酸PCR檢測(cè)。
目前，推薦使用16S rRNA基因檢測(cè)方法，有條件的實(shí)驗(yàn)室，可進(jìn)一步選用熱休克蛋白基因groEL擴(kuò)增方法。
1. DNA提取
用急性期、未使用抗生素的EDTA抗凝血或非抗凝血血球部分、白細(xì)胞及蜱研磨液提取DNA。后，以AE緩沖液50µl抽濾以提高回收的DNA濃度。如采用血液白細(xì)胞層提取DNA，可明顯提高陽性檢出率。實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)采集當(dāng)?shù)卣Ｈ搜和瑫r(shí)提取DNA，作為PCR的陰性對(duì)照。
2. PCR擴(kuò)增
（1）16S rRNA基因檢測(cè)：16S rRNA 高度保守，是PCR檢測(cè)常用的擴(kuò)增靶基因，巢式PCR檢測(cè)可提高檢測(cè)靈敏度和特異度，采用屬特異及種特異引物同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。PCR檢測(cè)應(yīng)分區(qū)進(jìn)行，避免污染。PCR反應(yīng)混合物的準(zhǔn)備按常規(guī)進(jìn)行。*輪反應(yīng)采用外引物對(duì)Eh-out1和Eh-out2，DNA模板10µl（白細(xì)胞提取的DNA可適當(dāng)減少）。PCR反應(yīng)體系總體積為25µl或50µl（需要進(jìn)行PCR測(cè)序或克隆時(shí)，應(yīng)適當(dāng)擴(kuò)大反應(yīng)體系），其它成分的濃度按常規(guī)進(jìn)行。反應(yīng)程序如下：
94℃ 5min
40循環(huán)：94℃ 45sec
55℃ 50sec
72℃ 1min
72℃ 總延伸 5min
第二輪反應(yīng)使用2對(duì)引物分別進(jìn)行巢式PCR。2對(duì)引物分別是無形體屬及埃立克體屬通用內(nèi)引物（Eh-gs1、Eh-gs2）；以及HGA種特異性引物（HGA1及HGA2）。檢測(cè)樣本取*輪產(chǎn)物1-2µl為模板，陽性對(duì)照取0.5µl為模板。反應(yīng)程序同*輪反應(yīng)。
（2）熱休克蛋白基因groEL擴(kuò)增
與groEL基因的應(yīng)用相比，16S rRNA基因的應(yīng)用更為廣泛，但groEL基因在不同種屬間具有較大的變異性。因此，對(duì)于診斷及菌株的鑒定，groEL基因均具有重要意義。PCR檢測(cè)時(shí)，反應(yīng)混合物的準(zhǔn)備按常規(guī)進(jìn)行。DNA模板量同16S rRNA基因檢測(cè)。巢式PCR*輪反應(yīng)采用外引物對(duì)HS1及HS6。
反應(yīng)程序如下：
3循環(huán)：94℃ 1min
48℃ 2min
70℃ 90sec
37循環(huán)：88℃ 1min
52℃ 2min
70℃ 90sec
68℃ 總延伸 5min
第二輪PCR引物采用HS43及HS45。檢測(cè)樣本取*輪產(chǎn)物1-2µl為模板，陽性對(duì)照取0.5µl為模板。反應(yīng)程序同*輪反應(yīng)。反應(yīng)程序同*輪反應(yīng)，但退火溫度由52℃改為55℃。