抗血清的采集與保存具體說明

家兔是常用以產(chǎn)生抗體的動物，因此這里主要討論兔血的收集。羊等較大動物以頸靜脈、動脈取血，鼠等小動物取血可參閱有關(guān)資料。取兔血有兩種方法，一是耳緣靜脈或耳動脈放血，一是頸動脈入血，也可心臟采血。取動脈或靜脈放血時，將兔放入一個特造的木匣或籠內(nèi)，耳露于箱（籠）外，也可由另一人捉住兔身。剪去耳緣的毛，用少許二甲苯涂抹耳廓，30s后，耳血管擴(kuò)張、充血。用手輕拉耳尖，以單面剃須刀或尖的手術(shù)刀片，快速切開動脈或靜脈，血液即流出，每次可收集30～40ml 。然后用棉球壓迫止血，凝血后洗去二甲苯。二星期后，可在另一耳放血。此法可反復(fù)多次放血。頸動脈放血時，將兔仰臥，固定于兔臺，剪去頸部的毛，切開皮膚，暴露頸動脈，插管，放血。放血過程中要嚴(yán)格按無菌要求進(jìn)行。
收集的血液置于室溫下1h左右，凝固后，置4℃下，過夜（切勿冰凍）析出血清，離心，4000rpm,10min。在無菌條件，吸出血清，分裝（0.05～0.2ml），貯于-40℃以下冰箱，或凍干后貯存于4。C冰箱保存。
抗血清質(zhì)量的評價
在免疫期間，不僅各個不同的動物，而且同一動物在不同的時間內(nèi)抗血清效價、特異性、親合力等都可能發(fā)生變化，因而必須經(jīng)常地采血測試。只有在對抗血清的效價、特異性、親合力等方面作*的評價后，才可使用所取得的抗血清。
效價.抗血清的效價，就是指血清中所含抗體的濃度或含量。效價測定的方法常用的是放射免疫法，此法對所有的抗體均適用。某些由大分子（如蛋白類）抗原所產(chǎn)生的抗體，可用雙擴(kuò)散等方法測定。前者測定的效價極為。而后者則粗糙得多。
放射免疫法： 以不同稀釋度的抗血清與標(biāo)記抗原混合，孵育24h后，測定其結(jié)合率。通常以結(jié)合率為50%的血清稀度和為效價。如某抗血清的結(jié)合率為50%時的稀釋度為1：15000，則該血清的效價就是1：15000?？寡宓男r，除由抗血清本身的性質(zhì)決定外，還受標(biāo)記抗原的質(zhì)量、孵育時間，所用稀釋液的成分及其pH等因素的影響，在工作中必須引起注意。（測定方法見第8章　）
雙向擴(kuò)散法：利用大分子抗原和抗體在瓊脂平板上擴(kuò)散，兩者在相交處產(chǎn)生沉淀線，以觀察和判斷抗血清中是否有抗體及其濃度。
球脂板的制備：100ml pH7.1 的磷酸鹽緩沖液加到15g的瓊脂內(nèi)，于水浴中加溫，攪拌，使瓊脂*溶解，趁熱用紗布過濾，待溶液冷卻到65℃左右時，加入疊氮鈉（NaN3），使其在溶液中的濃度為0.1%。用移液管把瓊脂放在干凈平皿或玻片上，約3mm厚，待其冷卻，*凝固后，用打孔器打孔（圖2-4）。中央孔內(nèi)加適量抗原（容量為50μl），周圍各孔內(nèi)分別加入50μl 1：2、1：4、1：8、1：16、1：32及不稀釋的抗血清，37℃下孵育24h，觀察有無沉淀線產(chǎn)生，以判斷血清的稀釋度.
2．特異性測定?？寡宓奶禺愋曰蚍Q專一性是指抗血清對相應(yīng)的抗原及近似的抗原物質(zhì)的識別能力。特異性好就是抗血清的識別能力強(qiáng)。通常，特異性是以交叉反應(yīng)率來表示的。交叉反應(yīng)率低，表示抗血清的特異性好，反之則特異性差。交叉反應(yīng)率一般是用競爭抑制曲線來判斷的。以不同濃度的抗原和近似抗原物質(zhì)分別做競爭抑制曲線，計算各自的結(jié)合率（B/T或B/B0），求出各自在IC50時的濃度，按下列公式計算交叉反應(yīng)率。
　　S=y/Z×100%
　　S：交叉反應(yīng)率，y：IC50時抗原濃度，Z：IC50時近似抗原物質(zhì)的濃度。
如某抗原的IC50濃度為90Pg/管，而一些近似抗原物質(zhì)IC50濃度幾乎是無限大，可以說這一抗血清與其它抗原物質(zhì)的交叉反應(yīng)率近似零，即無交叉反應(yīng)，該抗血清的特異性是好的。
3．親合力。免疫學(xué)中， 親合力是指抗體與結(jié)合抗原體的活度或牢固度。抗體與抗原結(jié)合疏松，結(jié)合后會迅速解離，稱為親合力低，反之，親合力高。親合力的高低是由抗原分子的大小，抗體分子的結(jié)合位點與抗原的決定基之間的立體結(jié)構(gòu)型的合適程度決定的。親合力常以親合常數(shù)K表示。K的單位是升/摩爾（L/mol）。在RIA中，K是該抗血清能達(dá)到的小檢出量（靈敏度）的倒數(shù)，K=1/[H]，[H]是小檢出量，通常，K的范圍在108～1012L/mol之間，也有高達(dá)1014L/mol的。
計算親合常數(shù)的方法20余種，計算出的K都不能真實反映實驗情況，只能作為參考。