干貨|免疫組化的成功經(jīng)驗(yàn)和失敗教訓(xùn)，看這篇就夠了！

復(fù)雜的石蠟制片，繁瑣的脫蠟染色讓實(shí)驗(yàn)的菜鳥們對免疫組化實(shí)驗(yàn)望而卻步。每每做IHC時(shí)，每一步都小心翼翼，精益求精，等待掃描結(jié)果時(shí)，內(nèi)心總是獨(dú)白：“你已經(jīng)是一個(gè)成熟而的切片了，該展示你的精彩了”。但理想是美好的，現(xiàn)實(shí)是骨感的，總會遇到各種“疑難雜癥”，實(shí)驗(yàn)還是得繼續(xù)摸索。究竟如何得到的免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，索萊寶為您歸納總結(jié)了一些常見問題和實(shí)驗(yàn)小技巧。

  免疫組化（IHC）知識大講堂  

石蠟切片在染色過程中出現(xiàn)脫片現(xiàn)象怎么回事？

1）有些組織本身就容易掉片，如骨組織等，操作時(shí)沖PBS不要直接沖到組織上，沖到組織上方，讓它流下沖洗組織；

2）烤片時(shí)間不夠，或溫度不夠，可以適當(dāng)延長烤片時(shí)間和提高烤片溫度；

3）組織切的不好，切片機(jī)的問題例如比較老的舊的機(jī)器切的厚或者不均勻，或者切片者手法不好等；

4）操作的時(shí)候甩的太猛了，有脫片嫌疑的片子要不甩或輕輕甩，用衛(wèi)生紙從邊緣上慢慢吸水；

5）展片沒有展開，撈片時(shí)有氣泡；

6）用高溫修復(fù)時(shí)，溫度驟冷也可能引起。用含有多聚賴氨酸的玻片有助于粘附，索萊寶提供了多聚賴氨酸粘附載玻片。

組織切片為什么產(chǎn)生非特異性染色？

1）標(biāo)本染色過程中干片會導(dǎo)致非特異性著色；

2）PBS沖洗不充分，殘留抗體會增強(qiáng)著色，應(yīng)注重洗滌過程；

3）抗體孵育時(shí)間過長、抗體濃度高也易增加背景著色。這可通過縮短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來控制。使用索萊寶推薦的稀釋比例對抗體進(jìn)行稀釋。多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，也可以試用索萊寶的單克隆抗體；

4）內(nèi)源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細(xì)胞多的組織），需要通過延長滅活時(shí)間和增加滅活劑濃度來降低背景染色； 

5）非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過延長二抗來源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當(dāng)增加濃度來加強(qiáng)封閉效果； 

6）DAB孵育時(shí)間過長或濃度過高。

為什么免疫組化染色呈陰性結(jié)果？

1）抗體濃度和質(zhì)量問題以及抗體來源選擇錯(cuò)誤；

2）抗原修復(fù)不全。若微波效果不佳，還可高壓修復(fù)；

3）組織切片本身這種抗原含量低；

4）血清封閉時(shí)間過長；

5）DAB孵育時(shí)間過短；

6）細(xì)胞通透不全，抗體未能充分進(jìn)入胞內(nèi)參與反應(yīng)；

7）建議先做個(gè)陽性對照片，排除抗體等外的方法問題。

為什么背景高？

1）考慮一抗?jié)舛雀撸?/span>

2）調(diào)整DAB孵育時(shí)間；

3）也要考慮血清封閉時(shí)間是否過短；

4）適當(dāng)增加抗體孵育后的浸洗次數(shù)和延長浸洗時(shí)間等。

邊緣效應(yīng)怎么辦？

1）組織邊緣與玻片粘貼不牢，邊緣組織松脫漂浮在液體中。解決辦法：制備的膠片（APES或多聚賴氨酸），切出盡量薄的組織切片，不厚于4微米，組織的前期處理應(yīng)規(guī)范，盡量避免選用壞死較多的組織；

2）切片上滴加的試劑未充分覆蓋組織，邊緣的試劑容易先變干，濃度較中心組織高而致染色深。解決辦法：試劑要充分覆蓋組織，應(yīng)超出組織邊緣2mm。用組化筆畫圈時(shí)，為了避免油劑的影響，畫圈應(yīng)距組織邊緣3-4mm。

DAB顯色后發(fā)現(xiàn)切片著色不均勻？

1）切出的片子厚度本身可能就不一樣，切出一片厚，一片薄，這樣可能造成著色深淺不一；

2）有可能是你的顯色液底物加到片子上后沒有搖勻，造成局部底物濃度不一致，所以加完顯色液后要將片子來回左右晃動(dòng)幾下，使片子上所有區(qū)域的底物濃度一致；

3）如果你的片子是中間的染色深，靠近邊上的淺，那有可能是你組化筆圈畫的太小，顯色液覆蓋的面積不過大而產(chǎn)生了邊緣效應(yīng)。外側(cè)的組織片要離顯色液外緣0.5cm。

  免疫組化（IHC）的TIPS  

1. 組織固定越新鮮越好，盡快固定，多選用4%多聚甲醛固定液。但對于不同的組織和抗原，可選用不同的固定液；

2. 組織脫水和透明時(shí)間不能太長，否則在切片時(shí)容易碎片，切不完整；

3. 切片展片時(shí)有些組織在切片后難以在水中展開，這時(shí)可適當(dāng)?shù)卦谒屑尤霂椎我掖迹?/span>

4. 烤片：要控制烤片的溫度和時(shí)間，溫度太高或時(shí)間太長，抗原容易丟失?？酒臅r(shí)候把切片呈60°角斜立，切片和載玻片之間的水滴或氣泡會從邊緣滑出，減少對切片的損壞；

5. 蠟塊及切片的保存：要在4℃保存；

6. 脫片問題：Poly-L-Lysine(多聚賴氨酸)為目前免疫組化染色工作中常用的一種防脫片劑，6ml的多聚賴氨酸溶液可按1:10稀釋成60ml的工作液，適合于需要酶消化、微波、高溫高壓的防脫片處理。如不行，可用雙重處理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。在以上兩種條件都行不通的情況下，可用如下方法：切片在脫蠟前，放在APES 1：50丙酮溶液中浸泡3min，晾干，即可進(jìn)行下一步；

7. 滅活內(nèi)源性酶：HRP系統(tǒng)：3%雙氧水滅活；AP系統(tǒng)：3%HAc滅活；

8. 暴露抗原：對于不同的組織，不同的抗原，不同的抗體，所采用的方法應(yīng)不一樣，可進(jìn)行熱修復(fù)、胰酶消化、既不修復(fù)也不消化。膠原還可以用胃蛋白酶消化等；

9. 封閉：在山羊血清封閉，非特異性染色仍然較強(qiáng)時(shí)，可延長封閉時(shí)間或用濃縮血清封閉；

10. 抗體稀釋：應(yīng)遵循“現(xiàn)用現(xiàn)配”的原則，對于PBS稀釋的抗體一定要當(dāng)天使用；

11. 背景高：在抗體濃度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度等合適的條件下，如果背景依舊高，可采用含1‰ Tween20的PBS洗，特別是在顯色之前要多洗；

12. 顯色：DAB顯色時(shí)間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時(shí)間，到出現(xiàn)淺棕色本底時(shí)即可沖洗；若很短時(shí)間就出現(xiàn)背景很深，還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長封閉時(shí)間；

13. 返藍(lán)：在蘇木素復(fù)染后，可用堿性緩沖液（如PBS）或Na2HPO4的飽和溶液返藍(lán)；

14. 整個(gè)操作過程中，切片千萬不能干燥，否則會有非特異性染色。

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  此刻，相信您不會做不好啦  

  可是，但是，還是做不好怎么辦  

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