堿性條件下，蛋白將Cu2+還原為Cu+， Cu+與BCA試劑形成紫藍(lán)色的絡(luò)合物，測(cè)定其在562nm處的吸收值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，即可計(jì)算待測(cè)蛋白的濃度。常用濃度的去垢劑SDS，Triton X-100，Tween不影響檢測(cè)結(jié)果，但受螯合劑(EDTA, EGTA)、還原劑（DTT，巰基乙醇）和脂類(lèi)的影響。實(shí)驗(yàn)中，若發(fā)現(xiàn)樣品稀釋液或裂解液本身背景值較高，可試用Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒。

操作說(shuō)明：

一. 微孔酶標(biāo)儀法

1. 配制工作液：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品數(shù)量，按50體積BCA試劑加1體積Cu試劑（50:1）配制成BCA工作液，充分混勻(混合時(shí)可能會(huì)有渾濁，但混勻后就會(huì)消失)。BCA工作液室溫24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

2. 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品：取10μL BSA標(biāo)準(zhǔn)品用PBS稀釋100μL（樣品一般可用PBS稀釋），使終濃度為0.5mg/mL。將標(biāo)準(zhǔn)品按0, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 20μL加到96孔板的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品孔中，加PBS補(bǔ)足20μL。

3. 將樣品作適當(dāng)稀釋（一般要多做幾個(gè)梯度，如作2倍、4倍、8倍稀釋），加20μL到96孔板的樣品孔中。由于移液器在取小量樣品時(shí)誤差偏大，標(biāo)準(zhǔn)線前面的點(diǎn)可能不很準(zhǔn)確，所以盡可能的讓樣品點(diǎn)落在標(biāo)準(zhǔn)線1/2后。

4. 各孔加入200μL BCA工作液，37℃放置15-30分鐘。用酶標(biāo)儀測(cè)定A562nm，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白濃度。使用溫箱孵育時(shí)，應(yīng)注意防止因水分蒸發(fā)影響檢測(cè)結(jié)果。

二. 分光光度計(jì)法 如沒(méi)有酶標(biāo)儀，可用分光光度計(jì)在離心管中混勻后加入比色皿中比色。步驟如下：

1. 配制工作液: 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品數(shù)量，按50體積BCA試劑加1體積Cu試劑（50:1）配制成BCA工作液，充分混勻(混合時(shí)可能會(huì)有渾濁，但混勻后就會(huì)消失)。BCA工作液室溫24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

2. 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品：取100μL BSA標(biāo)準(zhǔn)品用PBS稀釋1mL（樣品一般可用PBS稀釋），使終濃度為0.5mg/mL。

3. 取八支（或者更多）5mL離心管，標(biāo)上號(hào)，按下表加入試劑。

BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

4.37℃放置15-30分鐘。用分光光度計(jì)測(cè)562nm處吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白濃度。

注意事項(xiàng)：

1. 長(zhǎng)期不用時(shí)，Cu試劑與PBS稀釋液可置于2-8℃保存，如發(fā)現(xiàn)細(xì)菌污染則應(yīng)丟棄。BCA試劑在低溫條件下出現(xiàn)結(jié)晶沉淀時(shí)，可37℃溫育使其*溶解, 不影響使用。

2. 樣品中若含有較多干擾物質(zhì)時(shí)，請(qǐng)采用Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒。

3. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

相關(guān)產(chǎn)品：

PC0001 BSA 標(biāo)準(zhǔn)品（5mg/ml）

PC0021 BCA 試劑

PC0030 Lowry 法蛋白濃度測(cè)定試劑盒

PC0010 Bradford 法蛋白濃度測(cè)定試劑盒

R0010 RIPA 組織/細(xì)胞快速裂解液

R0050 核蛋白抽提試劑盒

P1200 SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒

T1070 5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液

PR1600 預(yù)染低分子量蛋白 Marker

P1015 4×蛋白上樣緩沖液（含 DTT）

D1060 10×電泳轉(zhuǎn)移緩沖液

PE0010 ECL Plus 熒光檢測(cè)試劑(ECL 超敏發(fā)光液)

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