索萊寶質(zhì)粒小量提取試劑盒的使用方法

索萊寶質(zhì)粒小量提取試劑盒的使用方法

質(zhì)粒是細(xì)胞內(nèi)的一種環(huán)狀的小分子DNA，是DNA重組的常用載體，在DNA重組中，質(zhì)?；蚪?jīng)過改造后的質(zhì)粒載體可通過連接外源基因構(gòu)成重組體。在質(zhì)粒提取過程中，多數(shù)質(zhì)粒粗提取物中含有三種構(gòu)型的質(zhì)粒：共價(jià)閉合環(huán)DNA（cccDNA）、質(zhì)粒的兩條鏈沒有斷裂、超螺旋開環(huán)DNA（ocDNA）、質(zhì)粒的一條鏈斷裂、松弛的環(huán)狀分子線形DNA（lDNA）：質(zhì)粒的兩條鏈均斷裂；線性分子質(zhì)粒DNA的分子構(gòu)型。

質(zhì)粒小量提取的方法

1.將3~5ml菌液13,000rpm離心30秒收集沉淀（菌體）。 如果用1.5ml或2ml離心管則需反復(fù)離心2～3次。

2.倒掉上清，將沉淀（菌體）*懸浮于100μl懸 浮液（溶液I）中。上清要盡可能去除干凈，可用濾紙吸干。沉淀要 用混旋器*懸浮，否則將直接導(dǎo)致下一步的裂 解不*，進(jìn)而影響質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量和純度。

3.加入150μl裂解液（溶液II），輕柔地顛倒混勻10 次左右，溶液逐漸變得粘稠、清亮。不可用混旋器劇烈振蕩，否則會(huì)使質(zhì)粒DNA斷裂； 裂解時(shí)間不宜超過5分鐘，否則會(huì)造成染色體DNA 的污染及質(zhì)粒DNA的產(chǎn)率降低。

4.加入150μl中和液（溶液III），輕柔地顛倒混勻10 次左右。 此時(shí)可見到白色絮狀的染色體DNA及細(xì)菌碎片。

5.13,000rpm離心8~10分鐘，將上清液小心轉(zhuǎn)入一 37個(gè)新的1.5ml離心管中，加入0.4ml純化樹脂（使 用前充分混勻），顛倒混勻3分鐘。此步是通過離心去除染色體DNA及細(xì)菌碎片，并使處于高鹽狀態(tài)下的質(zhì)粒DNA與純化樹脂結(jié)合。

6.將純化樹脂及上清液的混合物吸入離心純化柱中，13.000rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液。

7.將離心純化柱重新套入廢液收集管中，加入600μl 80%異丙醇（或80%乙醇），13.000rpm離心1分 鐘，倒掉收集管中的廢液。 如果離心純化柱底部殘留有異丙醇（或乙醇），可 用濾紙吸干，否則將影響以后的酶促反應(yīng)。此步 是洗滌質(zhì)粒DNA中混有的雜質(zhì)及鹽類。

8.重復(fù)第7步1~2次，盡可能將雜質(zhì)去除。

9. 取出離心純化柱，將其套入一個(gè)干凈的1.5ml離 心管，開蓋放置2~3分鐘，將殘留的異丙醇(或乙 醇)揮發(fā)干凈。加入50μl TE緩沖液(若用于測序， 則加50μl超純水)于純化樹脂上，不能粘在管壁 上。室溫下放置3分鐘后，13,000rpm離心1分鐘。 此步是將純化樹脂上的DNA洗脫下來。如果對(duì)質(zhì)粒DNA的需求量較大，則重復(fù)此步驟1～2次，這 樣可以獲得高產(chǎn)量的質(zhì)粒DNA。TE緩沖液或無菌 超純水的用量視用戶對(duì)濃度的要求而定。離心純化柱放入離心管中，若蓋不上蓋子，亦沒有關(guān)系,可開蓋離心。

10.離心管中收集的液體即是洗脫下來的質(zhì)粒 DNA，取1～2μl電泳（0.8%瓊脂糖，120V，15～ 20分鐘）檢測其純度并目測定量。 若發(fā)現(xiàn)有RNA 污染，可加入0.5μl RNase A （10mg/ml），37℃保溫30分鐘。此操作不影響其 后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

質(zhì)粒小量提取注意事項(xiàng)

1、使用前請(qǐng)先檢查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出現(xiàn)混濁，如有混濁現(xiàn)象，可在37℃水浴中加熱幾分鐘，待溶液恢復(fù)澄清后再使用。溶液Ⅱ、溶液Ⅲ和漂洗液使用后應(yīng)立即擰緊蓋子。

2、洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于50ul，體積過小影響回收效率;洗脫液的pH值對(duì)洗脫效率也有影晌，若需要用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在8.0左右(可用NaOH將水的pH值調(diào)此范圍)，pH值低于7. 0會(huì)降低洗脫效率，DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防DNA降解。

3、如果所提質(zhì)粒為低拷貝質(zhì)?；虼笥?0kb的大質(zhì)粒，應(yīng)加大菌體使用量，使用5-10ml過夜培養(yǎng)物，同時(shí)按照比例增加溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的用量，吸附和洗脫時(shí)可以適當(dāng)?shù)难娱L時(shí)間，以增加提取效率。

4、DNA濃度及純度檢測：得到的質(zhì)粒DNA純度與樣品保存時(shí)間、操作過程中的剪切力等因素有關(guān)。得到的DNA可用瓊脂糖疑膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測濃度與純度。 DNA應(yīng)在OD260處有顯著吸收峰，OD260值為1相當(dāng)于大約50ug/ml雙鏈DNA、 40ug/ml單鏈DNA。OD260/OD280比值應(yīng)為1.7-1.9，如果洗脫時(shí)不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水，比值會(huì)偏低，因?yàn)閜H值和離子存在會(huì)影響吸光值，但并不表示純度低。

北京索萊寶科技有限公司為生化試劑供應(yīng)商，專業(yè)生產(chǎn)銷售生化試劑、生物試劑、細(xì)胞培養(yǎng)、試劑盒、實(shí)驗(yàn)耗材等產(chǎn)品。質(zhì)粒小量提取試劑盒是索萊寶自產(chǎn)產(chǎn)品，本試劑盒采用堿裂解法裂解細(xì)胞，根據(jù)離心吸附柱在高鹽狀態(tài)下特異性地結(jié)合溶液中的DNA的原理特異性提取質(zhì)粒DNA。 離心吸附柱中采用的硅基質(zhì)材料能、專一地吸附DNA，可大限度去除雜質(zhì)蛋白及細(xì)胞中其他有機(jī)化合物。 使用本試劑盒提取的質(zhì)粒DNA可適用于各種常規(guī)操作，包括酶切、PCR、測序、連接和轉(zhuǎn)化等試驗(yàn)。