Western Blot內(nèi)參抗體選擇原則

Western Blot內(nèi)參抗體選擇原則

內(nèi)參抗體 種類很多，比如beta-actin、beta-tubunlin、GAPDH、α-tubunlin等，那么針對(duì)自己的實(shí)驗(yàn)，我們?cè)撊绾芜x擇呢?下面簡(jiǎn)單介紹下選擇內(nèi)參抗體應(yīng)遵循的原則：

 

一.樣本種屬來(lái)源：

 

先要考慮的就是實(shí)驗(yàn)樣本來(lái)源于什么物種。

1、哺乳動(dòng)物的組織或者細(xì)胞樣本，通常選擇β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H3、Na,K atp ase等。

2、植物來(lái)源實(shí)驗(yàn)樣本，則可以選擇plant actin、Rubisco等。

3、其他來(lái)源樣本研究較少，所以就應(yīng)該參照文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，選擇合適的蛋白 作為內(nèi)參。

 

二.目的蛋白分子量 ：

 

選擇內(nèi)參抗體時(shí)，應(yīng)該考慮目的蛋白分子 量的大小。通常應(yīng)該保證目的蛋白與內(nèi)參蛋白分子量相差5KD以上。比如目的蛋白分子量為45KD，此時(shí)不適宜選擇β-actin作為內(nèi)參，可以考慮選擇GAPDH或者β-tubulin作為內(nèi)參。

 

三.目的蛋白表達(dá) 部位：

 

就一般的蛋白檢測(cè)來(lái)說(shuō)，β-actin、β-Tubulin抗體等就可以了，而針對(duì)于核蛋白的定量，特別是樣本蛋白就是核蛋白時(shí)，選擇恰當(dāng)?shù)暮说鞍變?nèi)參則更能體現(xiàn)內(nèi)部參照的價(jià)值。常用的核內(nèi)參抗體有Lamin A、Lamin B、Histone H3，除此之外，其它常見(jiàn)的核蛋白內(nèi)參還有PCNA、K70、K80等，在一些文獻(xiàn)報(bào)道中，Erk2、TATA binding protein(TBP)以及c-Jun、c-Fos等都有使用。而對(duì)于膜蛋白檢測(cè)，常用的內(nèi)參抗體為Na,K ATPase。對(duì)于線粒體蛋白的檢測(cè)，常用VDAC1和COX IV作為內(nèi)參抗體。
 

以上幾條原則只是針對(duì)通常情況，但是需要注意的問(wèn)題是——內(nèi)參的選擇需要考慮實(shí)際的試驗(yàn)環(huán)境，比如某些細(xì)胞中，由于組織缺氧、糖尿病等因素會(huì)導(dǎo)致GAPDH的表達(dá)增高，不適合做內(nèi)參。比如在涉及細(xì)胞增殖相關(guān)試驗(yàn)中，c-Jun由于自身表達(dá)變化就不適合做內(nèi)參;而在凋亡實(shí)驗(yàn)時(shí)，TBP、Lamin等也不適合作為內(nèi)參。因此設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案的時(shí)候應(yīng)該考慮這些因素并查詢相應(yīng)文獻(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中也應(yīng)該注意如果內(nèi)參表達(dá)出現(xiàn)異常，應(yīng)考慮這方面因素。