細(xì)胞凍存與復(fù)蘇操作步驟與注意事項(xiàng)

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細(xì)胞凍存是細(xì)胞保存的主要方法之一。利用凍存技術(shù)將細(xì)胞置于-196℃液氮中低溫保存，可以使細(xì)胞暫時(shí)脫離生長狀態(tài)而將其細(xì)胞特性保存起來，這樣在需要的時(shí)候再復(fù)蘇細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。而且適度地保存一定量的細(xì)胞，可以防止因正在培養(yǎng)的細(xì)胞被污染或其他意外事件而使細(xì)胞丟種，起到了細(xì)胞保種的作用。 
 

一、原理
 

在不加任何條件下直接凍存細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會(huì)形成冰晶，能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生機(jī)械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、PH改變、蛋白變性等，能引起細(xì)胞死亡。如向培養(yǎng)液加入保護(hù)劑，可使冰點(diǎn)降低。在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水份在凍結(jié)前透出細(xì)胞。貯存在－130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。
細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)速度要快，使之迅速通過細(xì)胞易受損的－5～0℃，細(xì)胞仍能生長，活力受損不大。
 

目前常用的保護(hù)劑為二甲亞砜（DMSO）和甘油，它們對(duì)細(xì)胞無毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞。

二、細(xì)胞凍存與復(fù)蘇操作步驟
 

（一）凍存
 

1、消化細(xì)胞（同實(shí)驗(yàn)二），將細(xì)胞懸液收集離心管中。
2、1000rpm離心10分鐘，棄上清液。
3、沉淀加含保護(hù)液的培養(yǎng)，計(jì)數(shù)，調(diào)整5×106/ml左右。
4、將懸液分凍存管中，每管1 ml。
5、將凍存管口封嚴(yán)。如用安瓿瓶則火焰封口，封口一定要嚴(yán)，否則復(fù)蘇時(shí)易出現(xiàn)爆裂。
6、貼上標(biāo)簽，寫明細(xì)胞種類，凍存日期。凍存管外拴一金屬重物和一細(xì)繩。
7、按下列順序降溫：室溫→4℃（20分鐘〕→冰箱冷凍室（30分鐘）→低溫冰箱（－30℃ 1小時(shí)）→氣態(tài)氮（30分鐘）→液氮。
注意：操作時(shí)應(yīng)小心，以免液氮凍傷。液氮定期檢查，隨時(shí)補(bǔ)充，不能揮發(fā)干凈，一般30立升的液氮能用1～1.5月。
 

（二）復(fù)蘇
 

1.  細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行常規(guī)消毒，紫外照射40min以上。
2.  培養(yǎng)液（DMEM）、0.25％胰蛋白酶（Trypsin）恒溫水浴箱370C預(yù)熱20min，備用。
3.  二甲基亞砜（DMSO)在40C冰箱中冷藏30min，備用。
4.  從液氮保存罐中取出凍存管，立即放入400C水浴中，快速搖晃，直凍存液*融化。
5.  將細(xì)胞懸液移入15ml離心管，緩慢加入4ml培養(yǎng)液，離心（1000r/min，5min）。
6.  用培養(yǎng)液懸液混懸沉淀細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，方培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
7.  記錄復(fù)蘇日期。
 
三、注意事項(xiàng)
 

1.  取細(xì)胞的過程中注意帶好防凍手套，護(hù)目鏡。此項(xiàng)尤為重要，細(xì)胞凍存管可能漏入液氮，解凍時(shí)凍存管中的氣溫急劇上升，可導(dǎo)致爆炸。
 

2.  凍存液的問題：凍存液的配置已是常識(shí)，在這里不作詳述，但二甲基亞砜（DMSO）對(duì)細(xì)胞不是*無毒副作用，在常溫下，二甲基亞砜對(duì)細(xì)胞的毒副作 較大，因此，必須在1-2min內(nèi)使凍存液*融化。如果復(fù)蘇溫度太慢，會(huì)造成細(xì)胞的損傷，二甲基亞砜（DMSO）選擇進(jìn)口產(chǎn)品。
 

3.  離心前須加入少量培養(yǎng)液。細(xì)胞解凍后二甲基亞砜濃度較高，注意加入少量培養(yǎng)液可稀釋其濃度，以減少對(duì)細(xì)胞的損傷。
 

4.  離心問題：目前主要有兩種見解。一種是解凍后的細(xì)胞懸液直接吹打均勻后分裝到培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，第二天換液。因?yàn)殡x心的目的是兩個(gè)，去除 DMSO，去除死細(xì)胞，這個(gè)是標(biāo)準(zhǔn)流程，但對(duì)一般人來說，把握不好離心轉(zhuǎn)速和時(shí)間，轉(zhuǎn)的不夠活細(xì)胞沉底的少，細(xì)胞就全被扔掉了，轉(zhuǎn)過了活細(xì)胞會(huì)受壓過大， 死亡。此外在操作過程中容易污染，所以不推薦。另一種說法為細(xì)胞懸液中含有二甲基亞砜（DMSO），DMSO對(duì)細(xì)胞有一定的毒副作用，所以須將離心后的液 體前倒凈，且一定倒干凈。我在試驗(yàn)中按照常規(guī)的離心分裝的方法進(jìn)行復(fù)蘇，結(jié)果無有異常。
 

5.  細(xì)胞貼壁少的問題：教科書中說明凍存細(xì)胞解凍時(shí)1ml細(xì)胞液要加10ml－15m培養(yǎng)液，而在我的試驗(yàn)中的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)為培養(yǎng)基越少細(xì)胞越容易貼附。
 

6.  復(fù)蘇細(xì)胞分裝的問題：試驗(yàn)中我的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)為復(fù)蘇1管細(xì)胞一般可分裝到1-2只培養(yǎng)瓶中，分裝過多，細(xì)胞濃度過低，不利于細(xì)胞的貼壁。
 

7.  加培養(yǎng)基的量放入問題：這個(gè)量的多少的把握主要涉及到的問題是DMSO的濃度，從如果你加培養(yǎng)基的太少，那么DMSO的濃度就會(huì)比較大，就會(huì)影響 細(xì)胞生長，從以前的資料來看，DMSO的濃度在小于0.5%的時(shí)候?qū)σ话慵?xì)胞沒有什么影響，還有一個(gè)說法是1％。所以如果你的凍存液的濃度是 10％DMSO的話那么加10ml以上的培養(yǎng)基就恰好稀釋到了無害濃度。