質(zhì)粒DNA連接與轉(zhuǎn)化方法詳述

DNA連接酶催化兩雙鏈DNA片段相鄰的5’-磷酸和3’-羥基間形成磷酸二酯鍵。在分子克隆中有用的DNA連接酶是來自Ｔ４噬菌體的DNA 連接酶：T4 DNA連接酶。T4 DNA連接酶在分子克隆中主要用于：1、連接具有同源互補粘性末端的ＤＮＡ片段；2、連接雙鏈DNA分子間的平端；3、在雙鏈平端的DNA分子上添加合成的人工接頭或適配子。

目的DNA片段與載體DNA片段之間的連接方式（以T4DNA連接酶為例）主要有以下幾種：

（一）、具互補粘性末端片段之間的連接

大多數(shù)的核酸內(nèi)切限制酶都能夠根據(jù)識別位點切割DNA分子，形成1~4核苷酸單鏈的粘性末端。當載體和外源DNA用同一種限制性內(nèi)切酶切割時，產(chǎn)生相同的粘性末端，連接后仍保留原限制性內(nèi)切酶的識別序列；如果用兩種能夠產(chǎn)生相同的粘性末端的限制酶（同尾酶）切割時，雖然可以有效地進行連接，但是獲得的重組DNA分子消失了原來用于切割的那兩種限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列，這樣不利于從重組子上完整地將插入片段重新切割下來。

（二）、平末端的連接

載體分子和外源DNA插入片段并不一定總能產(chǎn)生出互補的粘性末端。實際上有許多情況都是例外的，因為有些限制酶切割DNA分子之后所形成的都是平末端的片段；有的實驗要用兩種不同的限制酶分別切割載體分子和外源DNA，形成的也多半是非互補的粘性末端或平末端；再如用機械切割法制備的DNA片段，PCR擴增的和化學合成的DNA片段或由RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA片段，也不會具有互補的粘性末端。

理論上任何一對DNA平末端均能在T4DNA連接酶催化下進行連接，這給不同DNA分子的連接帶來了方便。但是，平末端連接更為復(fù)雜，且速度也慢得多，因為一個平末端的5’磷酸基團或3’羥基與另一個平末端的3’羥基和5’磷酸基團同時相遇的機會顯著減少，通常平末端的連接速度為粘性末端的1/10~1/100。為了提高其反應(yīng)活性，一般選擇16℃較為合適。

外源目的基因與載體在體外連接重組后形成重組DNA分子，重組DNA分子必須導(dǎo)入適宜的受體細胞中方能使外源目的基因得以大量擴增或表達。隨著基因工程的發(fā)展，從低等的原核細胞，到真核細胞，進一步到結(jié)構(gòu)復(fù)雜的高等動、植物細胞都可以作為基因工程的受體細胞。選擇適宜的受體細胞已成為重組基因克隆或表達的基本前提之一。

轉(zhuǎn)化方法：重組質(zhì)粒DNA分子通過與膜蛋白結(jié)合進入受體細胞，并在受體細胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達的過程稱之為轉(zhuǎn)化（transformation）。細菌轉(zhuǎn)化的本質(zhì)是受體菌直接吸收來自供體菌的游離DNA片段，即轉(zhuǎn)化因子，并在細胞中通過遺傳交換將之組合到自身的基因組中，從而獲得供體菌的相應(yīng)遺傳性狀的過程。

以革蘭氏陽性細菌為例，細菌轉(zhuǎn)化的一種可能機制包括如下基本步驟：

（1）細菌感受態(tài)的形成；（2）轉(zhuǎn)化因子的吸收；（3）整合復(fù)合物前體的形成；（4）單鏈DNA轉(zhuǎn)化因子的整合；（5）轉(zhuǎn)化子的形成。

大腸桿菌是一種革蘭氏陰性菌，其細胞表面的結(jié)構(gòu)和組成均與革蘭氏陽性細菌有所不同，自然條件下很難進行轉(zhuǎn)化，其主要原因是轉(zhuǎn)化因子的吸收較為困難，尤其是那些與其親緣關(guān)系較遠的DNA分子更是如此。因此在大腸桿菌的重組質(zhì)粒DNA分子的轉(zhuǎn)化實驗中，很少采取自然轉(zhuǎn)化的方法，通常的做法是采用人工的方法制備感受態(tài)細胞，然后進行轉(zhuǎn)化處理，其中代表方法之一是Ca2誘導(dǎo)的大腸桿菌轉(zhuǎn)化法。

Ca2誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化：細菌處于容易吸收外源DNA狀態(tài)叫感受態(tài)，用理化方法誘導(dǎo)細胞進入感受態(tài)的操作叫致敏過程。重組DNA轉(zhuǎn)化細菌的技術(shù)操作關(guān)鍵就是通過化學方法，人工誘導(dǎo)細菌細胞進入一個敏感的感受態(tài)，以便外源DNA進入細菌內(nèi)。其原理是將處于對數(shù)生長期的細菌置于0℃，CaCL2低滲溶液中，菌細胞膨脹成球形，同時Ca2 使細胞膜磷脂層形成液晶結(jié)構(gòu)，使得位于外膜與內(nèi)膜間隙中的部分核酸酶離開所在區(qū)域，這就構(gòu)成了大腸桿菌人工誘導(dǎo)的感受態(tài)。

此時加入DNA，Ca2 又與DNA結(jié)合形成抗脫氧核糖核酸酶（Dnase）的羥基-磷酸鈣復(fù)合物，并粘附在細菌細胞膜的外表面上。經(jīng)短暫的42℃熱脈沖處理后，細菌細胞膜的液晶結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈擾動，隨之出現(xiàn)許多間隙，致使通透性增加，DNA分子便趁機進入細胞內(nèi)。 Ca2處理的感受態(tài)細胞，一般每微克DNA能獲得105～106個轉(zhuǎn)化子，環(huán)化重組子分子愈小，轉(zhuǎn)化率愈高，環(huán)狀DNA分子比線性DNA分子的轉(zhuǎn)化率高1000倍。