質(zhì)粒DNA連接與轉(zhuǎn)化方法詳述

DNA連接酶催化兩雙鏈DNA片段相鄰的5’-磷酸和3’-羥基間形成磷酸二酯鍵。在分子克隆中有用的DNA連接酶是來(lái)自Ｔ４噬菌體的DNA 連接酶：T4 DNA連接酶。T4 DNA連接酶在分子克隆中主要用于：1、連接具有同源互補(bǔ)粘性末端的ＤＮＡ片段；2、連接雙鏈DNA分子間的平端；3、在雙鏈平端的DNA分子上添加合成的人工接頭或適配子。

目的DNA片段與載體DNA片段之間的連接方式（以T4DNA連接酶為例）主要有以下幾種：

（一）、具互補(bǔ)粘性末端片段之間的連接

大多數(shù)的核酸內(nèi)切限制酶都能夠根據(jù)識(shí)別位點(diǎn)切割DNA分子，形成1~4核苷酸單鏈的粘性末端。當(dāng)載體和外源DNA用同一種限制性內(nèi)切酶切割時(shí)，產(chǎn)生相同的粘性末端，連接后仍保留原限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列；如果用兩種能夠產(chǎn)生相同的粘性末端的限制酶（同尾酶）切割時(shí)，雖然可以有效地進(jìn)行連接，但是獲得的重組DNA分子消失了原來(lái)用于切割的那兩種限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別序列，這樣不利于從重組子上完整地將插入片段重新切割下來(lái)。

（二）、平末端的連接

載體分子和外源DNA插入片段并不一定總能產(chǎn)生出互補(bǔ)的粘性末端。實(shí)際上有許多情況都是例外的，因?yàn)橛行┫拗泼盖懈頓NA分子之后所形成的都是平末端的片段；有的實(shí)驗(yàn)要用兩種不同的限制酶分別切割載體分子和外源DNA，形成的也多半是非互補(bǔ)的粘性末端或平末端；再如用機(jī)械切割法制備的DNA片段，PCR擴(kuò)增的和化學(xué)合成的DNA片段或由RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA片段，也不會(huì)具有互補(bǔ)的粘性末端。

理論上任何一對(duì)DNA平末端均能在T4DNA連接酶催化下進(jìn)行連接，這給不同DNA分子的連接帶來(lái)了方便。但是，平末端連接更為復(fù)雜，且速度也慢得多，因?yàn)橐粋€(gè)平末端的5’磷酸基團(tuán)或3’羥基與另一個(gè)平末端的3’羥基和5’磷酸基團(tuán)同時(shí)相遇的機(jī)會(huì)顯著減少，通常平末端的連接速度為粘性末端的1/10~1/100。為了提高其反應(yīng)活性，一般選擇16℃較為合適。

外源目的基因與載體在體外連接重組后形成重組DNA分子，重組DNA分子必須導(dǎo)入適宜的受體細(xì)胞中方能使外源目的基因得以大量擴(kuò)增或表達(dá)。隨著基因工程的發(fā)展，從低等的原核細(xì)胞，到真核細(xì)胞，進(jìn)一步到結(jié)構(gòu)復(fù)雜的高等動(dòng)、植物細(xì)胞都可以作為基因工程的受體細(xì)胞。選擇適宜的受體細(xì)胞已成為重組基因克隆或表達(dá)的基本前提之一。

轉(zhuǎn)化方法：重組質(zhì)粒DNA分子通過(guò)與膜蛋白結(jié)合進(jìn)入受體細(xì)胞，并在受體細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達(dá)的過(guò)程稱之為轉(zhuǎn)化（transformation）。細(xì)菌轉(zhuǎn)化的本質(zhì)是受體菌直接吸收來(lái)自供體菌的游離DNA片段，即轉(zhuǎn)化因子，并在細(xì)胞中通過(guò)遺傳交換將之組合到自身的基因組中，從而獲得供體菌的相應(yīng)遺傳性狀的過(guò)程。

以革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌為例，細(xì)菌轉(zhuǎn)化的一種可能機(jī)制包括如下基本步驟：

（1）細(xì)菌感受態(tài)的形成；（2）轉(zhuǎn)化因子的吸收；（3）整合復(fù)合物前體的形成；（4）單鏈DNA轉(zhuǎn)化因子的整合；（5）轉(zhuǎn)化子的形成。

大腸桿菌是一種革蘭氏陰性菌，其細(xì)胞表面的結(jié)構(gòu)和組成均與革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌有所不同，自然條件下很難進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其主要原因是轉(zhuǎn)化因子的吸收較為困難，尤其是那些與其親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的DNA分子更是如此。因此在大腸桿菌的重組質(zhì)粒DNA分子的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，很少采取自然轉(zhuǎn)化的方法，通常的做法是采用人工的方法制備感受態(tài)細(xì)胞，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)化處理，其中代表方法之一是Ca2誘導(dǎo)的大腸桿菌轉(zhuǎn)化法。

Ca2誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化：細(xì)菌處于容易吸收外源DNA狀態(tài)叫感受態(tài)，用理化方法誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入感受態(tài)的操作叫致敏過(guò)程。重組DNA轉(zhuǎn)化細(xì)菌的技術(shù)操作關(guān)鍵就是通過(guò)化學(xué)方法，人工誘導(dǎo)細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)入一個(gè)敏感的感受態(tài)，以便外源DNA進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)。其原理是將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌置于0℃，CaCL2低滲溶液中，菌細(xì)胞膨脹成球形，同時(shí)Ca2 使細(xì)胞膜磷脂層形成液晶結(jié)構(gòu)，使得位于外膜與內(nèi)膜間隙中的部分核酸酶離開(kāi)所在區(qū)域，這就構(gòu)成了大腸桿菌人工誘導(dǎo)的感受態(tài)。

此時(shí)加入DNA，Ca2 又與DNA結(jié)合形成抗脫氧核糖核酸酶（Dnase）的羥基-磷酸鈣復(fù)合物，并粘附在細(xì)菌細(xì)胞膜的外表面上。經(jīng)短暫的42℃熱脈沖處理后，細(xì)菌細(xì)胞膜的液晶結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈擾動(dòng)，隨之出現(xiàn)許多間隙，致使通透性增加，DNA分子便趁機(jī)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。 Ca2處理的感受態(tài)細(xì)胞，一般每微克DNA能獲得105～106個(gè)轉(zhuǎn)化子，環(huán)化重組子分子愈小，轉(zhuǎn)化率愈高，環(huán)狀DNA分子比線性DNA分子的轉(zhuǎn)化率高1000倍。