文獻解讀|細胞內(nèi)/外乳酸耗竭用于協(xié)同的腫瘤代謝治療和免疫治療

在腫瘤進展期間，腫瘤微環(huán)境（TME）促進腫瘤的侵襲性并防止腫瘤受到外部侵襲。近，許多學(xué)者將注意力集中在TME的調(diào)控方法上，以實現(xiàn)更好的抗腫瘤作用。其中包括原位產(chǎn)生O2以減少M2巨噬細胞的極化和腫瘤轉(zhuǎn)移，中和腫瘤pH以敏化化療以及抑制TME中過表達的酶來限制腫瘤轉(zhuǎn)移等。然而，由于TME的成分不斷更新，仍然很難實現(xiàn)*的TME逆轉(zhuǎn)。乳酸是TME中普遍存在的成分，腫瘤細胞的有氧糖酵解不斷產(chǎn)生乳酸，以為腫瘤提供能量。有文獻報道，乳酸堆積會影響免疫治療效果，而免疫治療是近年來有希望的腫瘤治療方法。

2019年11月6日，武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院副院長、生物醫(yī)用高分子材料教育部重點實驗室主任張先正教授（通訊作者），劉傳軍教授及其團隊提出了一種新穎的胞內(nèi)/胞外乳酸耗竭策略，構(gòu)建了一個具有胞內(nèi)/胞外乳酸耗盡功能的級聯(lián)催化納米系統(tǒng)，并將其與免疫檢查點封鎖ICB治療結(jié)合協(xié)同抗腫瘤代謝治療和免疫治療。本研究團隊所制備的PMLR納米系統(tǒng)可通過ATP阻斷有效抑制腫瘤生長。同時，納米體系在TME中表現(xiàn)出的乳酸耗盡效應(yīng)，從而激活了天然免疫和原位細胞免疫。重要的是，這種有效的TME調(diào)控策略可激活腫瘤局部免疫，大大改善了免疫檢查點阻斷療法的治療效果，并可克服免疫激動劑引起的系統(tǒng)毒性的問題。該研究成果已發(fā)表在Advanced Materials 期刊上，IF=25.809。博士研究生高凡和博士研究生唐穎為共同一作者，張先正教授為該文章的通訊作者。

題目：

Intra/Extracellular Lactic Acid Exhaustion for Synergistic Metabolic Therapy and Immunotherapy of Tumors

期刊：Advanced Materials

影響因子：25.809

PMID：31692128

一作者：

博士研究生高凡和博士研究生唐穎為共同一作者

作者單位：武漢大學(xué)

索萊寶合作產(chǎn)品：

對于腫瘤免疫治療，免疫檢查點封鎖（ICB）治療已實現(xiàn)了的臨床益處，因為它可以重新激活自體T細胞殺死腫瘤細胞。但不幸的是，ICB療法的療效受到了免疫抑制性TME的限制。因此調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境（TME）是改善抗腫瘤治療的一種有前途的策略。該研究構(gòu)建了一個負載乳酸氧化酶（LOX）和糖酵解抑制劑（3PO），包被紅細胞膜（mRBC）的中空MnO2（HMnO2）催化納米系統(tǒng)（PMLR），用于細胞內(nèi)/外乳酸消耗以及代謝和免疫的協(xié)同抗腫瘤療法。得益于mRBC的長循環(huán)特性，納米系統(tǒng)可以通過增強的通透性和保留效應(yīng)（EPR）逐漸在腫瘤部位累積。細胞外納米系統(tǒng)通過LOX催化乳酸的氧化反應(yīng)，從而消耗TME中的乳酸。同時，細胞內(nèi)的納米系統(tǒng)釋放糖酵解抑制劑以切斷乳酸源，并通過阻斷三磷酸腺苷（ATP）的供應(yīng)來實現(xiàn)抗腫瘤代謝療法。此外，PMLR納米系統(tǒng)可以催化內(nèi)源H2O2的分解產(chǎn)生O2，可以同時用于增敏細胞外和細胞內(nèi)的過程。

結(jié)果表明，PMLR納米系統(tǒng)可以不斷去除乳酸，然后產(chǎn)生具有免疫功能的TME。此外，這種TME調(diào)節(jié)策略可有效提高抗PDL1治療的腫瘤效果，而且無需使用任何免疫激動劑來避免自身免疫。

1、材料的合成以及體內(nèi)作用過程

如圖所示，使用中空MnO2（HMnO2）納米顆粒作為載體，負載3PO（糖酵解抑制劑）和乳酸氧化酶（LOX）。將得到的納米結(jié)構(gòu)（PML）包被在紅細胞膜（mRBC）上，形成級聯(lián)催化納米體系（PMLR）。LOX用于催化乳酸與O2的氧化反應(yīng)，副產(chǎn)物可以被HMnO2進一步催化生成O2接著用于乳酸氧化。PMLR納米系統(tǒng)被腫瘤細胞攝入后，在酸性溶酶體中被內(nèi)源性H2O2降解，釋放3PO抑制糖酵解。這一過程伴隨著O2的生成，可以敏化3PO對糖酵解的抑制作用。此外，MRBC的偽裝旨在通過“不吃我”的信號來小化巨噬細胞（重要免疫細胞）對PMLR納米系統(tǒng)的內(nèi)吞作用，從而減輕PMLR納米系統(tǒng)對免疫系統(tǒng)的毒性。因此，PMLR納米系統(tǒng)有望在不使用任何激動劑的情況下有效地逆轉(zhuǎn)免疫抑制性TME并改善ICB治療。

2、PMLR納米顆粒的表征

通過掃描電子顯微鏡（SEM）和透射電子顯微鏡（TEM）圖像顯示，HMnO2納米粒子尺寸約為65nm。RBC涂層和3PO/LOX的負載幾乎不影響HMnO2納米顆粒的形態(tài)結(jié)構(gòu)。通過高角度環(huán)形暗場掃描透射電子顯微鏡（HAADF­STEM）顯示了主要元素的分布。發(fā)現(xiàn)樣品中的Mn和O元素分布在外圍。X射線光電子能譜分析出納米顆粒中錳的+4價態(tài)。對HMnO2納米顆粒的表面積和平均孔徑分析得到HMnO2納米顆粒適合裝載小分子藥物。之后，作者用紫外可見光譜識別在PMLR納米顆粒的制備過程中產(chǎn)生的不同中間產(chǎn)物，結(jié)果表明納米粒子在每一步都得到了成功的修飾。為進一步驗證mRBC的成功包封，作者用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）的方法分析出mRBC的蛋白質(zhì)被廣泛地保留在PMLR納米粒子上。此外，PMLR納米粒在血清溶液和PBS中的水動力大?。▓D1k）流體力學(xué)尺寸和多分散指數(shù)（PDI）的微小變化表明PMLR納米系統(tǒng)具有良好的穩(wěn)定性。

3、PMLR納米顆粒對H2O2分解和乳酸氧化的催化性能的研究

H2O2溶液與PMLR納米體系的混合生成大量的O2，產(chǎn)率隨著H2O2濃度的增加而增加。作者在不同PH值下評估了PMLR納米系統(tǒng)在H2O2存在下的O2生成能力，表明酸性TME對HMnO2納米載體的催化性能影響不大。為了評估乳酸的消耗能力，將裝有1mL PMLR納米顆粒溶液的透析袋浸入乳酸鈉（NaL）溶液中，暴露于空氣中37°C搖動。按設(shè)定的時間間隔抽取透析液樣本進行乳酸檢測。與PMLR納米粒子接觸的透析液中乳酸的濃度逐漸降低，這意味著PMLR納米系統(tǒng)保持了LOX的催化活性。作者的研究結(jié)果顯示出PMLR納米體系可以催化H2O2的分解生成O2，得到的O2可用于乳酸氧化，進一步驗證了添加H2O2時PMLR在低氧狀態(tài)下的乳酸消耗能力。在缺氧條件下，PMLR納米粒的乳酸消耗受到很大阻礙，而加入H2O2反應(yīng)繼續(xù)進行。這些結(jié)果證明了PMLR納米體系的級聯(lián)催化性能。

Mn²⁺廣泛應(yīng)用于腫瘤診斷的磁共振成像（MRI）造影劑之一，在不同條件下檢測了PMLR納米顆粒中Mn²⁺釋放，當(dāng)H2O2和H+同時存在時，Mn²⁺。接下來，研究了不同處理后PMLR納米粒子的體外MRI性能。與Mn²⁺的釋放。所有這些結(jié)果都表明，PMLR納米系統(tǒng)可能具有腫瘤敏感性的MRI效應(yīng)，因為腫瘤組織過表達H2O2，腫瘤細胞的溶酶體呈酸性（pH 4.0-5.0）。

4、PMLR納米顆粒在細胞水平上的乳酸和ATP消耗效應(yīng)

3PO不僅可以切斷乳酸的來源，而且可以通過三磷酸腺苷（ATP）阻斷來抑制細胞增殖。巨噬細胞（M1型）作為TME的一種成分，與抗腫瘤免疫關(guān)重要，并且還依賴糖酵解來增殖。為了減輕3PO對巨噬細胞的糖酵解抑制作用，將mRBC包裹在載體上以限制巨噬細胞的吞噬作用。PMLR納米顆粒上的CD47蛋白與其在巨噬細胞上表達的受體SIRPα之間存在相互作用，從而將“不吃我”信號傳遞給巨噬細胞，從而限制了吞噬細胞的吞噬作用。通過生物透射電鏡跟蹤PMLR納米顆粒的吸收情況，結(jié)果表明PMLR納米顆?？梢栽谌苊阁w中降解釋放藥物。然后，作者研究了不同含氧環(huán)境下ATP的阻斷效應(yīng)，證明了PMLR在低氧狀態(tài)下的自增敏功能。盡管在乳酸氧化過程中消耗了O2，但PMLR納米系統(tǒng)可能會進一步催化副產(chǎn)物H2O2生成O2來減輕缺氧現(xiàn)象和3PO敏化。在細胞水平上也評估了PMLR納米系統(tǒng)的乳酸消耗效果，所有結(jié)果表明，PMLR由于細胞內(nèi)/細胞外靶向策略和自敏化功能而顯示出有效的乳酸吸收能力。

作者又進一步驗證了PMLR納米系統(tǒng)的缺氧抑制能力，結(jié)果表明，PMLR納米體系能在一定程度上緩解缺氧，但隨著H2O2的消除，這種效應(yīng)被消除?？傊壜?lián)催化功能賦予PMLR納米顆粒抑制腫瘤細胞和消耗乳酸的能力。

5、PMLR納米顆粒在體內(nèi)的可行性的研究

血液參數(shù)的檢測結(jié)果表明PMLR納米顆粒具有良好的生物安全性。藥物動力學(xué)實驗結(jié)果表明，PMLR具有良好的血液保留能力，這將有助于PMLR納米顆粒的腫瘤蓄積。對PMLR納米粒子的體內(nèi)MRI效應(yīng)的研究結(jié)果進一步證實了PMLR納米系統(tǒng)對腫瘤的優(yōu)異靶向和聚集作用。作者進一步在體內(nèi)評估了PMLR納米系統(tǒng)的乳酸消耗效果，結(jié)果表明PMLR納米系統(tǒng)在體內(nèi)仍保持良好的效果。且PMLR納米系統(tǒng)消耗乳酸主要是由于細胞內(nèi)/細胞外策略和自敏功能。

6、PMLR納米顆粒對免疫抑制性TME的研究

據(jù)報道，乳酸可通過多種機制引起免疫抑制性TME，例如通過維持HIF1α蛋白促進M2巨噬細胞極化，通過下調(diào)活化T細胞核因子（NFAT）來使T細胞和NK細胞失活。以及通過抑制NF-kB途徑減少促炎細胞因子的分泌。因此，作者在轉(zhuǎn)錄組水平上對不同治療后的腫瘤組織進行免狀況分析，結(jié)果顯示PMLR組中免疫相關(guān)基因明顯上調(diào)，這意味著PMLR納米系統(tǒng)的乳酸耗竭能有效激活腫瘤的免疫應(yīng)答。同時作者還發(fā)現(xiàn)PMLR催化納米系統(tǒng)激活的免疫反應(yīng)主要取決于“ toll樣受體信號傳導(dǎo)途徑”，“細胞因子-細胞因子受體相互作用”和“ NF-kB信號傳導(dǎo)途徑，發(fā)現(xiàn)PMLR主要通過“ toll樣受體信號傳導(dǎo)途徑”和“ NF-κB信號傳導(dǎo)途徑”激活巨噬細胞、先天免疫。說明PMLR納米體系對腫瘤免疫微環(huán)境具有良好的調(diào)控能力，有助于提高現(xiàn)有免疫治療的療效。

7、PMLR納米顆粒與PDL1療法相結(jié)合對抗腫瘤作用的分析

許多研究者利用先天性免疫激動劑來提高基于ICB的免疫療法的敏感性。考慮到其良好的先天免疫誘導(dǎo)能力，作者將PMLR納米系統(tǒng)與程序性細胞死亡蛋白配體1（PD­L1）阻斷療法（α­PDL1）結(jié)合使用，實驗結(jié)果顯示PMLR納米系統(tǒng)調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境可以明顯提高ICB治療的療效。為了進一步評估治療效果，收集不同組的腫瘤組織進行HE染色，結(jié)果顯示，在PMLR加α­PDL1組的腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)了大的損傷區(qū)域，這表明聯(lián)合治療具有良好的抗腫瘤作用。且器官中的損傷可忽略不計，證明了其治療方法的生物安全性。同時，PMLR加α­PDL1組的實驗小鼠的生存期明顯高于其他組，顯示出MLR和α-PDL1聯(lián)合治療具有良好的協(xié)同抑瘤作用。

8、PMLR納米顆粒與PDL1療法相結(jié)合對免疫功能影響的分析

巨噬細胞和T細胞分別作為先天免疫和細胞免疫的典型細胞。作者分別用不同的方法檢測先天免疫和細胞免疫的功能。流式結(jié)果顯示PMLR組中活化T細胞的比例增加，表明PMLR納米系統(tǒng)具有良好的細胞免疫激活能力。對于腫瘤浸潤巨噬細胞分析表明PMLR和PMLR加α­ PDL1組的M2巨噬細胞比例明顯降低。該結(jié)果歸因于PMLR納米系統(tǒng)的有效的乳酸消耗能力，因為乳酸可以誘導(dǎo)M2巨噬細胞的分化。M2巨噬細胞與腫瘤的生長，轉(zhuǎn)移和免疫抑制有關(guān)，PMLR和PMLR加上αPDL1組的M1/M2比率升高也表明PMLR可以改善免疫抑制性TME。后，作者檢測到了兩種典型的免疫激活細胞因子IFN­-γ和IL-­6（ELISA檢測試劑盒購自索萊寶，產(chǎn)品貨號分別為SEKM-0031 and SEKM-0007）。PMLR加α-PDL1組腫瘤內(nèi)兩種細胞因子的高水平也顯示了聯(lián)合治療的良好協(xié)同免疫效果。

本研究團隊成功構(gòu)建了一個具有胞內(nèi)/胞外乳酸耗盡功能的級聯(lián)催化納米系統(tǒng)，并將其與抗PDL1療法相結(jié)合用于協(xié)同抗腫瘤治療的代謝療法和免疫療法。所制備的PMLR納米系統(tǒng)可通過ATP阻斷有效抑制腫瘤生長。同時，納米體系在TME中表現(xiàn)出的乳酸耗盡效應(yīng)，從而激活了天然免疫和原位細胞免疫，上述過程既可通過PMLR納米體系本身缺氧緩解作用敏化，又進一步放大PMLR納米體系的功能。綜上所述，PMLR納米系統(tǒng)可以不斷去除TME中的乳酸，形成免疫活化的TME。重要的是，這種有效的TME調(diào)控策略可激活腫瘤局部免疫，大大改善了免疫檢查點阻斷療法的治療效果，并可克服免疫激動劑引起的系統(tǒng)毒性的問題。

ELISA analysis for evaluating the IFN-γ and IL-6 content in the tumor site. Numbers 1–8, respectively represent the PBS, MR, MLR, PMR, MLR, α-PDL1, PMLR, PMLR plus α-PDL1 groups. In (d–f,h–j), statistical significance was calculated through the one-way ANOVA with Tukey post-hoc analysis, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.

產(chǎn)品評星：☆☆☆☆☆

索萊寶ELISA研發(fā)平臺

文章題目：

Enzyme-Driven Membrane-Targeted Chimeric Peptide for Enhanced Tumor Photodynamic Immunotherapy

PMID：31566945

IF：13.903

雜志名稱：

ACS Nano

引用產(chǎn)品：

SEKM-0007：Mouse IL-6 ELISA Kit

合作單位：

武漢大學(xué)

文章題目：

Microneedle-Assisted Transdermal Delivery of Etanercept for Rheumatoid Arthritis Treatment

PMID：31096705

IF：4.773

雜志名稱：

Pharmaceutics

引用產(chǎn)品：

SEKM-0034：Mouse TNF-α ELISA Kit

合作單位：

鄭州大學(xué)

文章題目：

Antidiabetic effects of water-soluble Korean pine nut protein on type 2 diabetic mice

PMID：31228801

IF：3.7

雜志名稱：

biomedicine & pharmacotherapy

引用產(chǎn)品：

SEKM-0141：Mouse Insulin ELISA Kit

合作單位：

哈爾濱工業(yè)大學(xué)

文章題目：

Hydrogen gas reduces HMGB1 release in lung tissues of septic mice in an Nrf2/HO-1-dependent pathway

PMID：30660872

IF：3.361

雜志名稱：

International Immunopharmacology

引用產(chǎn)品：

SEKM-0034：Mouse TNF-α ELISA Kit

SEKM-0007：Mouse IL-6 ELISA Kit

SEKM-0010：Mouse IL-10 ELISA Kit

合作單位：

天津醫(yī)科大學(xué)

文章題目：

Eriodictyol Attenuates Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury through the Activation of JAK2

PMID：29441020

IF：3.2

雜志名稱：

Frontiers in Physiology

引用產(chǎn)品：

SEKR-0017：Rat CRP ELISA Kit

合作單位：

濱州醫(yī)學(xué)院

文章題目：

Immunomodulatory effects of collagen hydrolysates from yak (Bos grunniens) bone on cyclophosphamide-induced immunosuppression in BALB/c mice

IF：3.19

雜志名稱：

Journal of Functional Foods

引用產(chǎn)品：

SEKM-0034：Mouse TNF-α ELISA Kit

SEKM-0007：Mouse IL-6 ELISA Kit

SEKM-0002：Mouse IL-1β ELISA Kit

合作單位：

中國農(nóng)業(yè)大學(xué)

文章題目：

iTRAQ-based proteomic analysis explore the influence of hypoxia on the proteome of dental pulp stem cells under 3D culture

PMID：29327447

IF：3.106

雜志名稱：

Proteomics

引用產(chǎn)品：

SEKH-0013： Human IL-6 ELISA Kit

合作單位：

重慶醫(yī)科大學(xué)

文章題目：

Resveratrol exhibits an effect on attenuating retina inflammatory condition and damage of diabetic retinopathy via PON1

PMID：30503749

IF：2.998

雜志名稱：

Experimental Eye Research

引用產(chǎn)品：

SEKR-0002：Rat IL-1β ELISA Kit

SEKR-0005：Rat IL-6 ELISA Kit

SEKR-0009：Rat TNF-α ELISA Kit

SEKR-0008：Rat IFN-γ ELISA Kit

SEKR-0024：Rat MCP-1 ELISA Kit

合作單位：

西安培華學(xué)院

文章題目：

Evaluation and comparison of immunogenicity and cross-protective efficacy of two inactivated cell culture-derived GIIa- and GIIb-genotype porcine epidemic diarrhea virus vaccines in suckling piglets

PMID：30827401

IF：2.791

雜志名稱：

Veterinary Microbiology

引用產(chǎn)品：

SEKP-0010：Porcine IFN-γ ELISA Kit

合作單位：

蘭州獸醫(yī)研究所