文獻(xiàn)解讀|PD-1與Ad-CEA疫苗同步接種對(duì)結(jié)腸癌生長抑制的影響

結(jié)腸癌（CRC）是目前流行的癌癥之一。盡管化療和生物制劑產(chǎn)生積極的療效，但晚期CRC對(duì)大多數(shù)人仍然具有致命性。錯(cuò)配修復(fù)缺陷的CRC對(duì)免疫檢查點(diǎn)封鎖（ICB）的反應(yīng)引起了人們對(duì)將免疫療法應(yīng)用于錯(cuò)配修復(fù)的CRC的興趣。癌胚抗原（CEA）是一種在多種常見癌癥中表達(dá)的腫瘤相關(guān)抗原（TAA），是一種廣泛應(yīng)用的腫瘤疫苗免疫靶點(diǎn)。

癌癥疫苗功效的局限性在于活化的T細(xì)胞對(duì)腫瘤的浸潤程度不高，以及對(duì)那些能夠轉(zhuǎn)移到腫瘤的T細(xì)胞免疫檢查點(diǎn)的上調(diào)。為改進(jìn)這一問題，都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院（都醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)學(xué)院）院長助理、腫瘤治療性疫苗北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任任軍教授及其團(tuán)隊(duì)提出了一種假設(shè)并得到證實(shí)，他們提出癌癥疫苗與免疫檢查點(diǎn)抑制劑的組合可能誘導(dǎo)更有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)。此前，他們?cè)鴪?bào)道過Ad-HER3疫苗接種可能會(huì)改變浸潤性T細(xì)胞的表型，并對(duì)小鼠乳腺癌模型中的免疫檢查點(diǎn)抑制產(chǎn)生反應(yīng)，在本次研究中他們研究了抗PD-1治療聯(lián)合Ad-CEA疫苗治療在小鼠結(jié)腸癌模型中誘導(dǎo)T細(xì)胞功能、細(xì)胞因子分泌和抗腫瘤免疫活性上大于任何一種單獨(dú)的方法。

題目：

Impact of synchronized anti-PD-1 with Ad-CEA vaccination on inhibition of colon cancer growth

期刊：Immunotherapy

影響因子：3.028

PMID：31192764

作者單位：都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院

目的：探討抗PD-1抗體的加入是否能提高Ad-CEA免疫小鼠結(jié)腸癌模型的免疫原性和抗腫瘤活性。方法：植入MC-38-CEA細(xì)胞前給予Ad-CEA，然后給予抗PD-1抗體。流式細(xì)胞儀和ELISPOT檢測(cè)CEA特異性T細(xì)胞反應(yīng)。采用脾細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞動(dòng)態(tài)共培養(yǎng)的方法，分析其抗腫瘤活性。用IHC法檢測(cè)淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤的浸潤。記錄腫瘤體積和總生存率。結(jié)果：Ad-CEA聯(lián)合抗PD-1抗體具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性。聯(lián)合用藥也增加了T細(xì)胞浸潤，但降低了Tregs。結(jié)論：Ad-CEA疫苗聯(lián)合抗PD-1抗體可增強(qiáng)抗腫瘤活性和免疫應(yīng)答。

1. Ad-CEA的體內(nèi)外轉(zhuǎn)移效率

為檢測(cè)Ad-CEA感染細(xì)胞和表達(dá)CEA的能力，用Ad-CEA-Luci感染NIH3T3細(xì)胞，檢測(cè)其熒光素酶和CEA的表達(dá)。NIH3T3細(xì)胞的體外BLI顯示熒光素酶信號(hào)呈病毒劑量依賴性增加（圖1A）。在沒有病毒的情況下沒有檢測(cè)到任何信號(hào)。CEA蛋白表達(dá)呈相似的病毒劑量依賴關(guān)系（圖1B）。注射到在C57BL/6小鼠足墊處后，主要在注射部位或注射部位檢測(cè)到癌胚抗原-熒光素（圖1C&D）。在顯微鏡下觀察器官的組織形態(tài)學(xué)，證實(shí)了Ad-CEA的安全性，因?yàn)樵谄鞴僦袥]有觀察到細(xì)胞病變作用。

2. Ad-CEA疫苗體內(nèi)誘導(dǎo)抗CEA免疫應(yīng)答的研究

用遞增劑量的Ad-CEA免疫C57BL/6小鼠，以評(píng)估CEA特異性細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)。如圖2A所示，隨著病毒劑量的增加，CEA特異性T細(xì)胞的數(shù)量增加（在脾細(xì)胞中）；然而，CEA抗體的滴度在較低劑量的Ad-CEA時(shí)趨于穩(wěn)定狀態(tài)（圖2B）。這些數(shù)據(jù)表明，抗體和T細(xì)胞應(yīng)答均由AD-CEA激活，但對(duì)大刺激的劑量要求不同。

3. Ad-CEA和抗PD-1抗體聯(lián)合治療可改善結(jié)腸癌小鼠模型的預(yù)后

為了評(píng)價(jià)抗PD-1抗體聯(lián)合Ad-CEA疫苗對(duì)荷瘤小鼠的療效，作者比較了未經(jīng)治療或經(jīng)Ad-CEA、PD-1抗體和PD-1抗體聯(lián)合Ad-CEA疫苗治療的小鼠的腫瘤生長情況（圖3A）。通過熒光成像（FLI）（圖3B）和物理測(cè)量（圖3C），與其他治療組相比，PD-1抗體與Ad-CEA合用，腫瘤的生長明顯減少。聯(lián)合治療組的平均腫瘤體積為1.73cm³，未治療對(duì)照組的平均腫瘤體積為6.42cm³。在腫瘤細(xì)胞接種后的第60天，對(duì)免疫小鼠的存活率進(jìn)行監(jiān)測(cè)（圖3D）。與對(duì)照組或單純Ad-CEA治療組相比，抗PD-1單藥治療提高了小鼠的生存率。聯(lián)合治療使中位生存期延長45天。作者用H&E染色評(píng)價(jià)了各器官的組織學(xué)和細(xì)胞形態(tài)學(xué)。不同器官的HE染色均無明顯的組織學(xué)異常和細(xì)胞形態(tài)學(xué)異常，提示治療方法安全，對(duì)小鼠無毒性作用（圖3S）。

4. Ad-CEA與抗PD-1聯(lián)合可減少Treg細(xì)胞并增強(qiáng)效應(yīng)T細(xì)胞反應(yīng)

為了闡明PD-1阻斷劑增強(qiáng)Ad-CEA抗腫瘤活性的免疫機(jī)制，作者先對(duì)不同組分小鼠腫瘤和脾細(xì)胞中T淋巴細(xì)胞的組成進(jìn)行了研究。與對(duì)照組相比，接受Ad-CEA+抗PD-1聯(lián)合治療的小鼠的CD4+TIL總頻率增加（圖4A）。CD8+TILs的頻率有增加的趨勢(shì)（圖4S-C）。在脾細(xì)胞內(nèi)，與對(duì)照組相比，單獨(dú)用Ad-CEA治療的小鼠的CD8+T細(xì)胞增加，但CD4+T細(xì)胞沒有增加（圖）。Ad-CEA聯(lián)合抗PD-1可增加CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞（圖5B）。此外，疫苗與PD-1抗體的結(jié)合顯著降低了腫瘤和脾臟中Tregs的頻率（圖4D和5C）。與所有其他實(shí)驗(yàn)組相比，用該組合物治療的小鼠的脾細(xì)胞顯示出明顯更高的IFN-γ水平（圖5D）和分泌IFN-r的抗原特異性淋巴細(xì)胞應(yīng)答（圖5F）。聯(lián)合用藥也能誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中IFN-r和GranB的高表達(dá)（圖4C和4E）。

PD-1阻斷后，PD1+CD8+T細(xì)胞百分比增加（圖5E）。相反，PD-L1在腫瘤組織中的表達(dá)在兩組之間沒有任何差異（圖4S-D）。與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)的圖像分析顯示，聯(lián)合治療后淋巴細(xì)胞的細(xì)胞溶解作用更強(qiáng)（圖6）。這些數(shù)據(jù)表明，用抗PD-1抗體和癌癥疫苗聯(lián)合治療小鼠可減少腫瘤浸潤treg并增強(qiáng)荷瘤小鼠T細(xì)胞的效應(yīng)功能。

5.Ad-CEA聯(lián)合抗PD-1對(duì)荷瘤小鼠血清細(xì)胞因子的影響

為探討Ad-CEA聯(lián)合抗PD-1抗腫瘤作用的關(guān)鍵因素，使用Luminex多重免疫分析法對(duì)四個(gè)實(shí)驗(yàn)組中每組小鼠血清樣品中的細(xì)胞因子水平進(jìn)行了分析。與對(duì)照組相比，Ad-CEA和抗PD-1抗體的組合可顯著提高血清IL-2，IL-12和CCL5的水平，并降低IL-10和TNF-α的水平（圖7）。

本研究團(tuán)隊(duì)在小鼠結(jié)腸癌模型中證實(shí)了Ad-CEA腫瘤疫苗和抗PD-1的聯(lián)合抗腫瘤作用，表明了系統(tǒng)性抗原特異性抗腫瘤免疫的發(fā)展。Ad-CEA和抗PD-1聯(lián)合應(yīng)用可以克服單一藥物治療的局限性。在晚期疾病之前進(jìn)行免疫接種可能產(chǎn)生大的效益。