文獻(xiàn)解讀|級(jí)聯(lián)響應(yīng)型納米平臺(tái)抑制乳酸外流增強(qiáng)腫瘤化學(xué)免疫治療

1.響應(yīng)GSH降解的納米顆粒的合成與表征

首先在前人研究的基礎(chǔ)上合成了固體二氧化硅納米顆粒（記為sSiO₂ NPs）。之后，以sSiO₂ NPs為基礎(chǔ)合成了中空介孔有機(jī)硅納米顆粒（命名為HMONs）。BSA用于阻斷裝載在HMONs中的HCPT（HMONs@HCPT-COOH），以降低納米顆粒對(duì)正常細(xì)胞的細(xì)胞毒性。實(shí)驗(yàn)表明，BSA能穩(wěn)定地在HMONs表面組裝。

為了有效的加載siMCT-4，PEI被裝載到HMONs@HCPT-BSA-COOH的表面。后，將PEG-CDM引入HMONs@HCPT-BSA-PEI表面，延長血液循環(huán)時(shí)間。實(shí)驗(yàn)表明成功合成了GSH降解中空介孔有機(jī)硅納米膠囊和PEG化PEI功能化BSA封阻的HMONs（HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG）。

2. 響應(yīng)GSH的藥物釋放和納米顆粒吞噬

由于實(shí)體瘤的這種異常代謝，腫瘤細(xì)胞內(nèi)會(huì)積累高劑量的還原性谷胱甘肽。基于實(shí)體腫瘤的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了一個(gè)納米藥物和siRNA傳遞系統(tǒng)，其具有弱酸性和GSH響應(yīng)性（HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4）。HCPT釋放結(jié)果表明（圖2A），納米平臺(tái)具有良好的GSH響應(yīng)能力。采用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）（圖2B）和激光共聚焦掃描顯微鏡（CLSM）（圖2C，D）對(duì)納米顆粒的吞噬作用進(jìn)行表征。由于CDM鍵的斷裂，暴露PEI可以增強(qiáng)B16F10的細(xì)胞攝取功效。PEG-CDM組對(duì)腫瘤微環(huán)境的弱酸反應(yīng)并暴露PEI組。B16F10細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)正電荷促進(jìn)吞噬作用，這與其他研究一致。在腫瘤細(xì)胞中，納米藥物和siRNA傳遞系統(tǒng)持續(xù)釋放化療藥物HCPT和siMCT-4，用于協(xié)同腫瘤化療免疫治療。

通過瓊脂糖凝膠阻滯試驗(yàn)驗(yàn)證納米顆粒負(fù)載siRNA的效果。結(jié)果表明，當(dāng)納米顆粒與siRNA的重量比（w:w）為10：1時(shí)，siRNA可以*負(fù)載。終的重量比為20：1，以供進(jìn)一步研究。通過免疫熒光（圖2E）和Western blotting實(shí)驗(yàn)（圖2F）驗(yàn)證了負(fù)載siMCT-4的納米顆粒對(duì)B16F10細(xì)胞中MCT-4表達(dá)的影響。結(jié)果表明，與其他組相比，負(fù)載siMCT-4的納米顆粒能有效抑制MCT-4的表達(dá)。

3.乳酸對(duì)體外巨噬細(xì)胞極化的影響

通過RAW264.7細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞（B16F10細(xì)胞和4T1細(xì)胞）共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證乳酸對(duì)體外巨噬細(xì)胞表型極化的影響（圖3A）。Western blotting檢測結(jié)果表明，HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4顯著沉默了B16F10細(xì)胞和4T1細(xì)胞中MCT-4的表達(dá)（圖3B）。經(jīng)HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4處理后，共培養(yǎng)液（RAW264.7細(xì)胞與B16F10細(xì)胞共培養(yǎng)）中的細(xì)胞外乳酸含量較其他處理低（圖3C）。同時(shí)，B16F10細(xì)胞的胞內(nèi)乳酸含量高于其他處理（圖3D）。以上結(jié)果與RAW264.7細(xì)胞與4T1細(xì)胞共培養(yǎng)模型的結(jié)果高度一致。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4可以抑制MCT-4的表達(dá)，并進(jìn)一步抑制B16F10細(xì)胞和4T1細(xì)胞的乳酸外流。

流式細(xì)胞儀檢測M1型標(biāo)記物CD86和M2型標(biāo)記物CD206的表達(dá)。結(jié)果提示HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4組M1型巨噬細(xì)胞比例明顯增加。HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4+forskolin組CD86表達(dá)下調(diào)，CD206表達(dá)上調(diào)。HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4+乳酸組也表現(xiàn)出與HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4組相反的趨勢，說明培養(yǎng)基中的乳酸在巨噬細(xì)胞表型極化中起著重要作用。此外，與僅用DMEM培養(yǎng)基組相比，B16F10或4T1細(xì)胞共培養(yǎng)組中CD86和CD206的表達(dá)略有上調(diào)（圖3E，F(xiàn)）。采用免疫熒光法檢測不同處理后CD86和CD206的表達(dá)情況。從CLSM圖像中可以看到HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4組CD86表達(dá)明顯增加，CD206表達(dá)明顯減少（圖3G，H）。其他組的結(jié)果及相關(guān)熒光定量統(tǒng)計(jì)（圖3I，J）與FCM檢測結(jié)果趨勢一致。以上結(jié)果表明，HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4在體外通過抑制乳酸外流顯著誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞表型向M1型極化。

4.納米平臺(tái)的細(xì)胞活力和細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)

本研究中，HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4在體外可顯著抑制B16F10和4T1細(xì)胞活力，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。Western blotting檢測不同處理后細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。WB結(jié)果顯示HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4+Forskolin和HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDMPEG@siMCT-4組顯著誘導(dǎo)B16F10細(xì)胞和4T1細(xì)胞中Bax的表達(dá)，但Bcl-2的表達(dá)受到抑制（圖4A），蛋白灰度定量統(tǒng)計(jì)結(jié)果一致（圖4B）。結(jié)果顯示，兩組均具有較高的細(xì)胞毒性，可顯著誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。與其他組相比，也顯著抑制了B16F10和4T1細(xì)胞活力（圖4C）。為了進(jìn)一步研究負(fù)載HCPT和siMCT-4的納米平臺(tái)的細(xì)胞毒性，作者使用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒確認(rèn)不同處理后的細(xì)胞毒性（圖4D）。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果提示兩組均能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，且有時(shí)間依賴性。HMONs-BSA-PEI-CDM-PEG具有輕微的細(xì)胞毒性。

5.利用納米平臺(tái)通過抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)乳酸外流激活巨噬細(xì)胞M2到M1極化和恢復(fù)體內(nèi)T細(xì)胞活性

為了驗(yàn)證MCT-4在體內(nèi)沉默的有效性，我們在各種治療后處死B16F10或4T1荷瘤Balb/c小鼠。對(duì)B16F10腫瘤組織（圖5A）和4T1腫瘤組織（圖5H）進(jìn)行Western blotting檢測MCT-4的表達(dá)。結(jié)果顯示HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4+Forskolin和HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4組抑制了MCT-4的表達(dá)。此外，通過檢測腫瘤組織細(xì)胞中乳酸含量和TME中乳酸含量，證明通過抑制乳酸在體內(nèi)的外流，腫瘤細(xì)胞中乳酸含量增加，TEM中乳酸含量降低。從相關(guān)結(jié)果（圖5C，D，I，J）中，作者發(fā)現(xiàn)HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM@siMCT-4+Forskolin和HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4組顯著抑制了B16F10和4T1荷瘤小鼠的乳酸外流量。

接下來作者研究了抑制乳酸外流對(duì)TAM表型極化和恢復(fù)體內(nèi)CD8⁺T細(xì)胞活性的影響，結(jié)果表明HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4組明顯降低了M2型TAMs的百分比（圖5D，F(xiàn)，K，M），同時(shí)增加了M1型TAMs的能力（圖5E，F(xiàn)，L，M）。免疫熒光法檢測B16F10腫瘤組織中TAM標(biāo)記物（CD11b）、M2型標(biāo)記物（CD206）和M1型標(biāo)記物（CD86）的表達(dá)。HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4組抑制了CD206的表達(dá)，誘導(dǎo)了CD86的表達(dá)，這與B16F10腫瘤組織的FCM檢測結(jié)果一致。檢測了B16F10或4T1腫瘤組織中Treg細(xì)胞的百分比，驗(yàn)證了工程化的納米平臺(tái)清除免疫抑制TME的效率。以上結(jié)果證實(shí)HMONs@HCPT-BSA-PEICDM-PEG@siMCT-4在體內(nèi)通過抑制乳酸外流的作用，有效地將TAMs的表型從M2型極化為M1型，降低Treg細(xì)胞的百分比，恢復(fù)CD8⁺T細(xì)胞的活性。

 6.體內(nèi)對(duì)腫瘤組織免疫應(yīng)答的恢復(fù)及對(duì)肺腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制

進(jìn)一步討論抑制乳酸外流在免疫抑制TME和激活體內(nèi)免疫應(yīng)答中的作用，相關(guān)結(jié)果表明，HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4組的相關(guān)免疫細(xì)胞比例明顯高于其他組（圖6A，B），證明HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4在體內(nèi)通過抑制乳酸外流，顯著緩解免疫抑制TME，激活免疫應(yīng)答。采用免疫熒光法檢測B16F10腫瘤組織中的免疫促進(jìn)因子（IFNγ、TNF-α）和免疫抑制因子（Arg1、TGF-β），分析其抗腫瘤作用機(jī)制。根據(jù)CLSM圖像，HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4組顯著誘導(dǎo)免疫促進(jìn)因子表達(dá)（圖6B），降低免疫抑制因子表達(dá)（圖6D）。對(duì)應(yīng)的熒光定量統(tǒng)計(jì)（圖6H）與FCM和IF檢測結(jié)果趨勢一致。上述結(jié)果表明，在免疫抑制TME中，乳酸是主要的免疫調(diào)節(jié)因子。通過抑制乳酸外流可以有效地將免疫抑制型腫瘤轉(zhuǎn)化為“熱”型腫瘤，在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)免疫應(yīng)答。

有研究表明，免疫抑制TME中乳酸含量與腫瘤細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。有報(bào)道使用Balb/c小鼠肺轉(zhuǎn)移模型來證明HMONs@HCPT-BSA-PEICDM-PEG@siMCT-4對(duì)B16F10細(xì)胞和4T1細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移的影響（圖6C）。經(jīng)不同處理后，肺組織圖像顯示HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4組明顯抑制肺轉(zhuǎn)移，減少了B16F10細(xì)胞（圖6D，E）和4T1細(xì)胞（圖6F，G）肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的形成。此外，H&E染色結(jié)果還顯示HMONs@HCPT-BSAPEI-CDM-PEG@siMCT-4組B16F10細(xì)胞和4T1細(xì)胞通過抑制乳酸外流轉(zhuǎn)移到肺組織。

7.體內(nèi)抗腫瘤效能

利用B16F10和4T1荷瘤小鼠研究HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDMPEG@siMCT-4在體內(nèi)的抗腫瘤效能（圖7A）。從圖7B的荷瘤圖像來看，HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4組與其他組相比，腫瘤生長明顯受到抑制。相關(guān)腫瘤體積（V/V₀）結(jié)果（圖7C）與荷瘤小鼠圖像趨勢一致。腫瘤組織重量結(jié)果顯示HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4組體內(nèi)抗腫瘤效果好（圖7D）。進(jìn)一步研究體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的凋亡情況，圖7E和F證實(shí)HMONs@HCPT-BSAPEI-CDM-PEG@siMCT-4組明顯誘導(dǎo)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞凋亡。相關(guān)的荷瘤生存率結(jié)果表明HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDMPEG@siMCT-4具有顯著的抗腫瘤效果，并顯著延長荷瘤小鼠的生存時(shí)間。

接下來揭示了HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4對(duì)Balb/c小鼠的生物相容性和細(xì)胞毒性，荷瘤小鼠的體重證明HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4在體內(nèi)具有良好的生物相容性。此外，HE染色圖像顯示HMONs@HCPT-BSAPEI-CDM-PEG@siMCT-4對(duì)主要臟器無毒副作用，而HCPT組肝臟毒性較輕，這與其他研究一致。

為了研究停止治療21天后腫瘤的復(fù)發(fā)，給4T1荷瘤小鼠用藥。從圖7E中4T1荷瘤小鼠的圖像來看，與其他組相比，HMONs@HCPT-BSA-PEICDM-PEG@siMCT-4組能顯著抑制腫瘤生長。相關(guān)腫瘤體積（V/V₀）結(jié)果（圖7F）與荷瘤小鼠圖像趨勢一致。腫瘤組織重量結(jié)果顯示，HMONs@ HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4組抗腫瘤效果優(yōu)于其他組（圖7G）。相關(guān)的腫瘤體積（V / V₀）證明了HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDMPEG@siMCT-4組在停止治療后激活了免疫反應(yīng)而顯著抑制腫瘤復(fù)發(fā)。從這些結(jié)果來看，HMONs@HCPT-BSAPEI-CDM-PEG@siMCT-4在體內(nèi)表現(xiàn)出良好的抗腫瘤效果，明顯延長荷瘤小鼠的生存時(shí)間，并有效抑制腫瘤復(fù)發(fā)。