一種增強單細胞免疫印跡檢測的光敏水凝膠

為了克服單細胞免疫印跡方法中的信號背景增強這一瓶頸，近，有報道稱2-芳基-5-羧基四唑-賴氨酸的類似物是一種良好的光親和標記材料，可用于蛋白質(zhì)靶標的原位固定和特異性位點結(jié)合。在這些類似物中，（1-甲基-1H-吡咯-2-基）-2H-四唑-5甲酰胺（mPyTC）與傳統(tǒng)的光活化基團（包括芳基酮，芳基疊氮化物和二疊氮基）相比，在選擇性蛋白質(zhì)靶標標記中顯示出更強的特異性。

受這些工作的啟發(fā)，作者在此提出了一種合適的聚丙烯酰胺交聯(lián)四唑基團，作為一種高效率、高選擇性的光活性水凝膠用于凝膠內(nèi)蛋白質(zhì)的光固定化。

MAP-mPyTC的紫外可見光譜在346nm處呈現(xiàn)一個峰值，是其的紫外激發(fā)波長。以此，用異硫氰酸熒光素（FITC）標記的牛血清白蛋白（BSA）評估了MMP凝膠固定光誘導蛋白性能。圖2c表明MMP在正常的電泳條件下，凝膠在不暴露于紫外線時仍保持穩(wěn)定性。圖2d表明只需要60s的紫外線照射MMP凝膠就能光固定蛋白質(zhì)。此外，MMP凝膠優(yōu)于先前報道BPMAC約85％的光捕獲效率。

作者進一步研究了固定光誘導蛋白的分子范圍，并通過結(jié)合各種分子量（BSA，卵清蛋白[OVA]，胰蛋白酶抑制劑[TI]和溶菌酶）的蛋白質(zhì)靶標而擴大了靶標庫。在60s內(nèi)成功捕獲了所有蛋白質(zhì)靶標，并且在分子量較小的情況下，捕獲動力學遵循相同的指數(shù)模式（圖2e）。在條件下（紫外線激發(fā)時間：60s，MAP-mPyTC濃度：0.6mM），作者觀察到蛋白質(zhì)靶標明顯固定在MMP凝膠上，效率分別為92.77±1.35％，分別為91.16±3.91％，86.45±2.81％和82.36±4.44％。

2、MMP凝膠的免疫印跡分離性能驗證

接下來，對MMP凝膠的性能進行了測試。掃描電子顯微鏡（SEM）圖像顯示凍干光敏感凝膠中清晰的多孔結(jié)構(gòu)（圖3a，左）。用Image J測量孔徑，結(jié)果表明MMP凝膠的孔徑與普通凝膠PA凝膠相似，而BP-PA凝膠的孔徑較?。▓D3a，右）。然后，基于這一理論作者研究了MMP凝膠的分離性能，結(jié)果表明，在電泳過程中總丙烯酰胺濃度的變化（%T，凝膠孔徑的調(diào)整）要優(yōu)于篩選蛋白質(zhì)靶大小。與PA和BP-PA凝膠電泳相似，觀察到MMP凝膠電泳具有較好的分離分辨率（圖3b）?？偟膩碚f，在電泳30s后MMP凝膠顯示了五種物種的良好分離。

凝膠內(nèi)免疫檢測的另一個瓶頸是水凝膠自熒光干擾，這是用于檢測靈敏度低的原位免疫印跡方法一個主要的瓶頸。為了檢測自體熒光對檢測靈敏度的影響，以牛血清白蛋白作為驗證靶，用抗牛血清白蛋白一抗和相應(yīng)的二抗在凝膠中進行檢測。從熒光圖像中觀察到，BP-PA凝膠中的背景熒光信號明顯較高（圖3d）。而分析物MMP中條帶信號較強（圖3e），信噪比顯著提高（圖3f）。此外，選擇性更高的官能團顯著避免了非特異性的結(jié)合。

3、MMP凝膠scWB的性能測試

作者采用常規(guī)流程（圖4a）來確定scWB的穩(wěn)定性，同時使用MMP凝膠分析了GES-1-GFP/GES-1細胞系和MGC803-GFP/MGC803細胞系的生物樣本（圖4b，c）。結(jié)果顯示GES-1-GFP/MGC803-GFP組和陰性對照組與常規(guī)免疫熒光成像和流式細胞術(shù)的結(jié)果相似（圖4d），紫外線對光捕獲靶抗原無不良影響，與其他mPyTC衍生物介導的蛋白質(zhì)研究相一致。

P-糖蛋白（P-gp）是ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白超家族的成員外排蛋白，與化療耐藥有關(guān)。研究P-gp表達譜的細胞間差異有助于闡明耐藥的潛在機制。為進一步驗證所制備的MMP凝膠的對目標蛋白的檢測能力，利用誘導劑（利福平）或抑制劑（維拉帕米）處理GES-1/MGC803細胞系，通過scWB對P-gp進行檢測其在細胞間的差異性。

Q-P-gp在MGC803腫瘤細胞中的表達高于GES-1正常胃粘膜上皮細胞（圖4e）。利福平誘導組和維拉帕米抑制組的P-gp在GES-1細胞中的表達有顯著差異。結(jié)果表明，MGC803腫瘤細胞比正常GES-1細胞具有更強的耐藥性，P-gp在GES-1細胞中的表達更易受到化學物質(zhì)的影響?；贛MP的scWB顯示的組間差異在傳統(tǒng)的免疫印跡分析中是觀察不到的。值得注意的是，在BP-PA凝膠中，維拉帕米治療組P-gp蛋白的熒光信號大多被光敏凝膠的背景熒光所掩蓋，但在MMP凝膠中卻可以清楚地觀察到（圖4f）。這些結(jié)果表明，作者提出的光敏感凝膠在單細胞分辨率下描繪了低豐度蛋白質(zhì)的表達水平，可以提供以往方法無法獲得的細胞間特異性。