教你成為平淡無奇的WB實(shí)驗(yàn)小能手—常見問題篇

A：

蛋白提取后-80℃可保存一年。建議分裝保存，避免反復(fù)凍融。

A：

一般建議進(jìn)行超聲處理，這樣可使樣本裂解更充分，對于核蛋白、核染色質(zhì)相關(guān)蛋白等難提取、復(fù)雜的蛋白，超聲處理是關(guān)鍵因素。

A：

必須進(jìn)行研磨、勻漿處理，做超聲處理，使蛋白質(zhì)溶解度會更好，離心要充分。組織中的蛋白酶活性更強(qiáng)，需要加入抑制蛋白酶活性的抑制劑，防止蛋白降解。

A：

提取的樣品中若含有去垢劑則需要選用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測定，若樣品中含有螯合劑(EDTA，EGTA)、還原劑（DTT，巰基乙醇）和脂類等，則需要選用Bradford法進(jìn)行蛋白濃度測定。

A：

細(xì)胞裂解物或組織勻漿的總蛋白的上樣量一般為20-40μg，純化蛋白的上樣量一般為10-100ng。

A：

一般5×10⁶足夠。但要看是哪種細(xì)胞，有的細(xì)胞的體積就很小，而有的細(xì)胞則鋪得很開。常規(guī)做WB一個孔道上樣要10⁵個細(xì)胞。但也和目的蛋白及提取的方式有關(guān)。如果是膜蛋白或是某細(xì)胞器內(nèi)分布的蛋白細(xì)胞數(shù)得增多。

A：

a)“微笑”是因?yàn)楣嗄z的時候冷卻不均勻，中間部分冷卻不好，導(dǎo)致凝膠中的分子有不同的遷移率所致。

b)“倒微笑”現(xiàn)象常常是由于垂直電泳時電泳槽的裝置不合適引起的，特別是當(dāng)凝膠和玻璃板組成的三明治底部有氣泡或靠近隔片的凝膠聚合不*，加APS和TEMED后應(yīng)該混合均勻。

c)電泳和轉(zhuǎn)膜溫度過高，點(diǎn)樣量太多或每孔點(diǎn)樣量不均勻，電泳電壓不穩(wěn)定或過高都可能引起條帶不整齊的現(xiàn)象。

A：

a)濾紙、膠、膜之間的大小，一般是濾紙≥膜≥膠。

b)濾紙、膠、膜之間千萬不能有氣泡，氣泡會造成短路。

c)保持膜的濕潤，若FVDF膜干燥，需要重新用甲醇活化。

A：

一般來講，BSA 會產(chǎn)生更清晰的結(jié)果，因?yàn)?BSA 含有較少的蛋白，抗體與之發(fā)生交叉反應(yīng)的概率較低。但并非總是如此，有些抗體在脫脂奶粉中的封閉效果更好，因?yàn)槊撝谭壑泻懈喾N類的封閉蛋白，能封閉更多不同類型的蛋白質(zhì)。

A：

一抗可用封閉液稀釋。二抗可用TBST稀釋，若感覺背景高也可以用封閉液進(jìn)行稀釋。若使用商品化的WB抗體稀釋液，則需要注意稀釋液中是否還有防腐劑（NaN₃），若含有則不能稀釋HRP標(biāo)記二抗。

A：

a)翻譯后修飾：蛋白發(fā)生如磷酸化、糖基化等翻譯后修飾時分子量會增加；

b)翻譯后剪切：蛋白發(fā)生剪切時分子量會降低，某些蛋白在合成時是作為前提蛋白合成的，然后剪切形成活性形式；

c)剪切異構(gòu)體：同一基因經(jīng)不同剪切方式可能產(chǎn)生不同大小的蛋白；

d)多聚體：比如蛋白二聚化；

e)電泳，膠濃度，蛋白Marker等因素也會影響實(shí)際蛋白分子量的判斷。

A：

a)內(nèi)參與目的蛋白分子量相差5KD以上

b)不同組織樣本在選擇內(nèi)參時存在一定差別

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