PCR定量試劑盒靈敏度的驗(yàn)證方法概述

　　PCR定量試劑盒在工業(yè)中的應(yīng)用主要存在一個(gè)方法驗(yàn)證的問(wèn)題，尤其是靈敏度的驗(yàn)證。靈敏度不夠，就會(huì)發(fā)生漏檢。另外，PCR所直接面對(duì)的樣本是DNA，而非病原菌或DNA，因此還需要做DNA抽提，這也是要注意的。

　　

　　藥典規(guī)定，生物藥廠的主細(xì)胞庫(kù)、工作細(xì)胞庫(kù)、生產(chǎn)終末細(xì)胞、檢定細(xì)胞、病毒種子批和病毒收獲液、細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)材料如培養(yǎng)基、胰酶、臨床治療用干細(xì)胞和免疫細(xì)胞等，都必須不含支原體。

　　

　　因此，如能采用PCR檢測(cè)支原體并替代藥典方法，還是能節(jié)省很多時(shí)間和精力。但PCR定量試劑盒的驗(yàn)證需要完整的方法。靈敏度驗(yàn)證是一個(gè)重要方面。靈敏度不夠，就會(huì)發(fā)生漏檢。

　　

　　具體驗(yàn)證可使用10CFU的支原體靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品，它一般為凍干粉形式，需要用待測(cè)樣本的樣本基質(zhì)（需保證里面不含支原體）來(lái)復(fù)溶，再進(jìn)行DNA抽提以及PCR檢測(cè)。如檢測(cè)的電泳有條帶，或者qPCR檢測(cè)后的Ct值小于40，即表明檢測(cè)成功。

　　

　　因此，在選用支原體PCR法檢測(cè)來(lái)替代藥典方法時(shí)，需要考慮如下兩個(gè)方面：

　　

　　一是要使用符合歐洲藥典要求，經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的支原體檢測(cè)試劑盒，二是自我驗(yàn)證，即確認(rèn)所用的樣本基質(zhì)對(duì)于該試劑盒方法是合適的，并且操作過(guò)程是正確的。小規(guī)模的室內(nèi)驗(yàn)證通常需要采用三個(gè)不同批次的試劑盒，然后加入10CFU的標(biāo)準(zhǔn)品，做復(fù)孔（通常是8個(gè)復(fù)孔），并且至少選擇3個(gè)支原體物種進(jìn)行驗(yàn)證。

　　

　　有的支原體標(biāo)準(zhǔn)品廠家會(huì)提供CFU與基因拷貝數(shù)的比值，以方便二者的換算。因?yàn)?0CFU只能確定PCR定量試劑盒能夠達(dá)到的檢測(cè)限在10CFU以下，但無(wú)法具體確定靈敏度的數(shù)值。帶DNA拷貝數(shù)標(biāo)定的基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品則可進(jìn)一步確定檢測(cè)限的數(shù)值。