實驗室詳解單克隆抗體的制備過程

單克隆技術(shù)又名雜交瘤技術(shù)。由G.KÖhler和Milstein1975年創(chuàng)立。主要原理是利用產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞雜交融合成雜交瘤細(xì)胞，生產(chǎn)抗體。

單克隆抗體的制備過程主要有以下六個環(huán)節(jié)，具體為抗原指標(biāo)、免疫動物選擇、免疫程序的確定、免疫、細(xì)胞雜交與選擇培養(yǎng)。

單抗制備步驟

1、抗原制備

制備單克隆抗體的免疫抗原，從純度上說雖不要求很高，但高純度的抗原使得到所需單抗的機會增加，同時可以減輕篩選的工作量。因此，免疫抗原是越純越好，應(yīng)根據(jù)所研究的抗原和實驗室的條件來決定。

2、免疫動物的選擇

根據(jù)所用的骨髓瘤細(xì)胞可選用小鼠和大鼠作為免疫動物。因為，所有的供雜交瘤技術(shù)用的小鼠骨髓瘤細(xì)胞系均來源于BALB/c小鼠，所有的大鼠骨髓瘤細(xì)胞都來源于LOU/c大鼠，所以一般的雜交瘤生產(chǎn)都是用這兩種純系動物作為免疫動物。但是，有時為了特殊目的而需進(jìn)行種間雜交，則可免疫其他動物。種間雜交瘤一般分泌抗體的能力不穩(wěn)定，因為染色體容易丟失。就小鼠而言，初次免疫時以8-12周齡為宜，雌性鼠較便于操作。

3、免疫程序確定

在設(shè)計免疫程序時，應(yīng)考慮到抗原的性質(zhì)和純度、抗原量、免疫途徑、免疫次數(shù)與間隔時間、佐劑的應(yīng)用及動物對該抗原的應(yīng)答能力等。沒有一個免疫程序能適用于各種抗原。免疫途徑常用體內(nèi)免疫法包括皮下注射、腹腔或靜脈注射，也采用足墊、皮內(nèi)、滴鼻或點眼。后一次加強免疫多采用腹腔或靜脈注射，目前尤其推崇后者，因為可使抗原對脾細(xì)胞作用更迅速而充分。在后一次加強免疫后第3天取脾融合為好，

注意：體內(nèi)免疫法適用于免疫原性強、來源充分的抗原，對于免疫原性很弱或?qū)C體有害（如引起免疫抑制）的抗原就不適用了。如果制備人單克隆抗體幾乎不大可能采用體內(nèi)免疫法。因此，針對這些情況，可采用體外免疫。所謂體外免疫就是將脾細(xì)胞（或淋巴結(jié)細(xì)胞，或外周血淋巴細(xì)胞）取出體外，在一定條件下與抗原共同培養(yǎng)，然后再與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。

4、免疫前準(zhǔn)備

佐劑是非特異性免疫增強劑，與抗原一起注射或預(yù)先注射入機體內(nèi)時，可增強機體對抗原的免疫應(yīng)答。

5、免疫

用佐劑和抗原按照1:1的比例進(jìn)行混合，混合后進(jìn)行磨合。磨合可以使用玻璃針管反復(fù)推拉，佐劑抗原滴入水中既不會產(chǎn)生大面積油花，也不會分層。取一定量佐劑抗原對免疫動物進(jìn)行分段多次注射。

注意：在注射的時候要小心，不要感染免疫動物。

6、細(xì)胞雜交與選擇培養(yǎng)

（1）雜交篩選：細(xì)胞雜交之前，要分別準(zhǔn)備好脾臟的B細(xì)胞懸液和小鼠骨髓瘤細(xì)胞。免疫后的小鼠脾臟在無菌條件下破碎，將B細(xì)胞懸浮在沒有血清的培養(yǎng)液中并洗滌3次去掉小鼠的血清。細(xì)胞用培養(yǎng)液洗滌2-3次，把兩種細(xì)胞合并在同—試管中，用50%的聚乙二醇作為融合劑，在37℃條件下融合1-2min。用培養(yǎng)液緩慢稀釋，除去PEG，將存活細(xì)胞分散HAT選擇培養(yǎng)板中。融合后的細(xì)胞在培養(yǎng)皿上用HAT培養(yǎng)液(培養(yǎng)液中含10%-20%胎?；蛐∨Ｑ搴虷AT)在37℃，5%CO2進(jìn)行培養(yǎng)。形成可用的細(xì)胞克隆后經(jīng)過幾次更換培養(yǎng)液后進(jìn)行抗體活性檢測（見抗體檢測）。分離單個細(xì)胞置入多孔培養(yǎng)板的每個孔中培養(yǎng)，檢測每孔細(xì)胞是否產(chǎn)生所注射抗原的抗體。

注意：在細(xì)胞融合后選擇性培養(yǎng)過程中，由于大量骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞相繼死亡，此時單個或少數(shù)分散的雜交瘤細(xì)胞多半不易存活，通常需要加入飼養(yǎng)細(xì)胞使之繁殖。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有胸腺細(xì)胞、正常脾細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞。

（2）細(xì)胞培養(yǎng)：將篩選出來的細(xì)胞直接注射到小鼠的腹部，培養(yǎng)3-4天。吸取培養(yǎng)好小鼠的腹水，將抽取的腹水進(jìn)行梯度離心就可以分離到純凈的單克隆抗體。

注意：細(xì)胞也可以在體外進(jìn)行培養(yǎng)，不過體外培養(yǎng)對環(huán)境要求，很容易就感染了菌株從而造成整個實驗的失敗。在抽取腹水的時候不要多次抽取，盡量一次抽取成功，否則很容易感染菌株。