免疫細(xì)胞的分離技術(shù) 外周血單個核細(xì)胞的分離

免疫細(xì)胞的分離技術(shù) 外周血單個核細(xì)胞的分離

用體外方法對機(jī)體各種具有免疫反應(yīng)的細(xì)胞分別作鑒定、計(jì)數(shù)和功能測定，是觀察機(jī)體免疫狀態(tài)的一種重要手段。為此，須將各種參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞從血液或臟器中分離出來。參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞主要包括淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等。實(shí)驗(yàn)根據(jù)不同需求有的僅需分離白細(xì)胞，有的則需分離單個核細(xì)胞（mononuclearcell），其中含淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞（monocyte），有的則需分離T細(xì)胞和B細(xì)胞以及其亞群。

• 白細(xì)胞包括以下細(xì)胞

外周血中單個核細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，其體積、形態(tài)和密度與其他細(xì)胞不同，紅細(xì)胞和多核白細(xì)胞密度較大，為1.090左右，而淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞密度為1.075～1.090。通過密度梯度離心，使一定密度的細(xì)胞按相應(yīng)密度梯度分布，從而將各種血細(xì)胞加以分離。常用的分層液有Ficoll和Percoll兩種。

（一）Ficoll分層液法

主要用于分離外周血中的單個核細(xì)胞。其主要成分是一種合成的蔗糖聚合物稱聚蔗糖（商品名為Ficoll），具有高密度、低滲透壓、無毒性的特點(diǎn)。高濃度的Ficoll溶液粘性高，易使細(xì)胞聚集，唯有與分層液密度相當(dāng)?shù)膯蝹€核細(xì)胞密集在血漿層和分層液的界面中，呈白膜狀，吸取該層細(xì)胞遞經(jīng)洗滌離心重懸。本法分離單個核細(xì)胞純度可達(dá)95％，淋巴細(xì)胞約占90％～95％，細(xì)胞獲得率可達(dá)80％以上，其高低與室溫有關(guān)，超過25℃時會影響細(xì)胞獲得率。

在某些情況下，分離所得細(xì)胞需要加以保存，否則活力迅速下降，甚死亡。

（一）短期保存技術(shù)

將分離到的細(xì)胞用適量含10％～20％滅活小牛血清的Hanks、Tc-199、RPMI1640或其他培養(yǎng)液稀釋重懸。所用培養(yǎng)液要求等滲，具緩沖作用，并對細(xì)胞無毒性。通常置4℃保存較好，可減低細(xì)胞代謝活動。要注意不要迅速改變細(xì)胞所處的溫度，以免造成細(xì)胞“溫度”休克。

（二）長期冷凍保存技術(shù)

利用液氮深低溫（－196℃）環(huán)境保存細(xì)胞，是當(dāng)前世界上通用的細(xì)胞長期保存技術(shù)。其原理在于深低溫環(huán)境可中斷細(xì)胞的代謝，但在降溫過程由于冰晶的形成和滲透壓的改變均可導(dǎo)致細(xì)胞的損傷和部分死亡，所以在冷凍過程中一定要加用冷凍保護(hù)劑，常用的保護(hù)劑為二甲亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）。

（二）Percoll分層液法

這是一種連續(xù)密度梯度離心分離法。Percoll是一種經(jīng)聚乙烯吡喀烷酮(PVP)處理的硅膠顆粒，對細(xì)胞無毒性。利用Percoll液經(jīng)高速離心后形成一個連續(xù)密度梯度的原理，將密度不等的細(xì)胞分離純化。離心后表層為死細(xì)胞殘片和血小板，底層為粒細(xì)胞和紅細(xì)胞，中間有兩層，上層富含單個核細(xì)胞(75％)，下層富含淋巴細(xì)胞(98％)。該法是純化單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的一各較好的方法，但操作流程較長，手續(xù)較多。