免疫沉淀的具體步驟說明

免疫沉淀是利用抗體特異性反應純化富集目的蛋白的一種方法?？贵w與細胞裂解液或表達上清中相應的蛋白結(jié)合后，再與蛋白A/G（ProteinA/G）或二抗偶聯(lián)的agarose或Sepharose珠子孵育，通過離心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗體-目的蛋白復合物，沉淀經(jīng)過洗滌后，重懸于電泳上樣緩沖液，煮沸5-10min，在高溫及還原劑的作用下，抗原與抗體解離，離心收集上清，上清中包括抗體、目的蛋白和少量的雜蛋白。

溶液制備

緩沖液：

50毫米Tris-HCl pH 7.4；

氯化鈉150毫米；

1毫米EDTA；

1% Triton1% x 100；

Na脫氧膽酸；

0.1% SDS；

1毫米的PMSF；

1μ克/毫升抑肽酶；

1μ克/毫升亮肽素；

PBS，pH7.4：

10毫米1.8毫米的磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈉50毫米，2.7毫米氯化鉀

1X樣品緩沖液：

65 mM Tris-Cl，pH8.0，10%（v/v）甘油，2.3%（W/V）SDS，

0.01%溴酚藍，1% DTT。

協(xié)議

1、 與pbs-edta或胰蛋白酶收獲細胞，計數(shù)細胞。

2、裂解細胞在預冷的緩沖液（1毫升/ 107細胞）在4個小時的1小時搖動。

3、離心20 min 14000克在4°c.transfer超游泳的一個新的管。

4、通過洗滌兩次制備蛋白質(zhì)/克瓊脂糖珠PBS和恢復到50%液珠懸浮用緩沖液。

5、預先明確的細胞裂解液加入50毫升珠漿每毫升細胞裂解液孵育4°C搖擺10分鐘，1000分鐘，4分鐘，10分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移到新管。

6、準備IP反應的移液0.5毫升預清除細胞裂解液（相當于5×10 6細胞）進入一個新的管添加1-4毫克抗體反應和孵化每搖擺在冰上3小時。佳的抗體量要求免疫沉淀的抗原的細胞是從一個給定的國家應該實證檢驗。

7、添加50%毫升50泥漿珠和巖石為1小時，在4角。

8、離心樣品在10000克為15秒微量離心機。仔細地丟棄的上清液。

9、兩次洗珠與1毫升緩沖液（去除非特異性相關(guān)蛋白），然后3次用1 ml PBS去除洗滌劑。

10、后，懸珠在60毫升的樣品緩沖液，和在95°C下煮沸5分鐘，離心樣品10000克15秒的離心加載前對聚丙烯酰胺凝膠電泳。