考馬斯亮藍(lán)測(cè)蛋白質(zhì)方法

蛋白質(zhì)濃度測(cè)定的方法有很多，考馬斯亮藍(lán)測(cè)定蛋白質(zhì)是實(shí)驗(yàn)室常見(jiàn)的一種方式，它利用比色法和色素法混合方法、操作簡(jiǎn)便，
考馬斯亮藍(lán)測(cè)蛋白質(zhì)原理：
考馬斯亮藍(lán)G-250(Coomassie?brilliant?blue?G-250)測(cè)定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種。該染料在游離狀態(tài)下呈紅色，在稀酸溶液中當(dāng)它與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，前者大光吸收?65nm，后者在595nm在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)（1-1000μg），蛋白質(zhì)與色素結(jié)合物在595nm波長(zhǎng)下的吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比，故可用于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。

考馬斯亮藍(lán)G-250于蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)十分迅速，2min左右即達(dá)到平衡。其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。此法靈敏度高，易于操作，干擾物質(zhì)少，是一種比較好的定量法。其缺點(diǎn)是在蛋白質(zhì)含量很高時(shí)線性偏低，且不同來(lái)源蛋白質(zhì)與色素結(jié)合狀況有一定差異。

材料、儀器設(shè)備及試劑

1、材料

小麥葉片、馬鈴薯塊莖、或其他植物材料

2、儀器設(shè)備<

分光光度計(jì)、研缽、燒杯、移液管

3、試劑

（1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：100μg·Ml-1牛血清白蛋白：稱取牛血清白蛋白25mg，加水溶解并定容100ml,吸取上述溶液40ml，用蒸餾水稀釋100ml即可。

（2）考馬斯亮藍(lán)G-250溶液：稱取100mg考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50ml90%乙醇中，加100ml85%（W/V）的磷酸，再用蒸餾水定容到1L，貯于棕色瓶中，常溫下可保存一個(gè)月。

考馬斯亮藍(lán)測(cè)蛋白質(zhì)方法：

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制?取6支具塞試管，按表加入試劑?；旌暇鶆蚝?，向各管中加入5ml考馬斯亮藍(lán)G-250溶液，搖勻，并放置5min左右，在595nm下比色測(cè)定吸光度。以蛋白質(zhì)

濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品測(cè)定

樣品提?。喝□r樣0.5g，加入2ml蒸餾水研磨，磨成勻漿后用6ml蒸餾水沖洗研缽，洗滌液收集在同一離心管中，在4000r/min下離心10min，棄去沉淀，上清液轉(zhuǎn)入容量瓶，以蒸餾水定容10ml，搖勻后待測(cè)

（2）吸取樣品提取液0.1ml，放入具塞試管中（每個(gè)樣品重復(fù)2次），加入5ml考馬斯亮藍(lán)<

G-250溶液，充分混合，放置2min后在595nm下比色，測(cè)定吸光度，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線查得蛋白質(zhì)含量。

（3）結(jié)果計(jì)算（單位mg/g）樣品中蛋白質(zhì)含量=（C·VT）/(1000?VS·WF)

（參考文獻(xiàn)：郝建軍，康宗利，于洋，植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006.12，107-109）

注意事項(xiàng)

在試劑加入后的5-20 min內(nèi)測(cè)定光吸收，因?yàn)樵谶@段時(shí)間內(nèi)顏色是穩(wěn)定的。

測(cè)定中，蛋白-染料復(fù)合物會(huì)有少部分吸附于比色杯壁上，測(cè)定完后可用乙醇將藍(lán)色的比色杯洗干凈。

利用考馬斯亮藍(lán)法分析蛋白必須要掌握好分光光度計(jì)的正確使用，重復(fù)測(cè)定吸光度時(shí)，比色杯一定要沖洗干凈，制作蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的時(shí)候，蛋白標(biāo)準(zhǔn)品好是從低濃度到高濃度測(cè)定，防止誤差