bradford法定量蛋白質(zhì)的實驗原理

Bradford法又稱考馬斯亮藍法，是 Bradford 于 1976 年建立起來的一種蛋白質(zhì)濃度的測定方法。bradford法定量蛋白質(zhì)的原理是馬斯亮藍（CBB）測定蛋白質(zhì)含量屬于染料結合法的一種。考馬斯亮藍在游離狀態(tài)下呈紅色，大光吸收在488nm；以下是bradford法定量蛋白質(zhì)的原理及含量測定流程
bradford法定量蛋白質(zhì)的原理
考馬斯亮藍（CBB）測定蛋白質(zhì)含量屬于染料結合法的一種?？捡R斯亮藍在游離狀態(tài)下呈紅色，大光吸收在488nm；當它與蛋白質(zhì)結合后變?yōu)榍嗌?，蛋白質(zhì)—色素結合物在595nm波長下有大光吸收。其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比，因此可用于蛋白質(zhì)的定量測定。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍結合在2min左右的時間內(nèi)達到平衡，完成反應十分迅速；其結合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。該法試劑配制簡單，操作簡便快捷，反應非常靈敏，靈敏度比Lowry法還高4倍，可測定微克級蛋白質(zhì)含量，測定蛋白質(zhì)濃度范圍為0～1 000μg/ml，是一種常用的微量蛋白質(zhì)快速測定方法。
bradford法定量蛋白質(zhì)的含量流程：
該方法用于大多數(shù)蛋白質(zhì)的定量是比較的，但不適用于小分子堿性多肽的定量。如核糖酸酶或溶菌酶。去污劑的濃度超過0．2%影響測定結果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。
1．Bradford濃染液的配制：將100mg考馬斯亮藍G-250溶于50ml 95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，然后，用蒸餾水補充1000ml，此染液放4℃少6個月保持穩(wěn)定。
2．標準曲線蛋白質(zhì)樣本的準備：盡量使用與待測樣本性質(zhì)相近的蛋白質(zhì)作為標準品，例如測定抗體，可用純化的抗體作為標準。如果待測樣本是未知的，也可用抗體作為標準蛋白。通常在20ug—150ug/100ul之間繪制標準曲線。
3．將待測樣本溶于緩沖溶液中，該緩沖溶液應與制作標準曲線的緩沖溶液相同(好用PBS)。
4．按1：5用蒸餾水稀釋濃染料結合溶液，如出現(xiàn)沉淀，過濾除去。
5．每個樣本加5ml稀釋的染料結合溶液，作用5～30min。染液與蛋白質(zhì)結合后，將由紅色變?yōu)樗{色，在595nm波長下測定其吸光度。注意，顯色反應不得超過30min．
6．根據(jù)標準曲線計算待測樣本的濃度。
注意：
考馬斯亮藍和皮膚中蛋白質(zhì)通過范德華力結合，反應快速，并且穩(wěn)定，無法用普通試劑洗掉。待一兩周左右，皮屑細胞自然衰老脫落即可無礙。
bradford法定量蛋白質(zhì)的原理是根據(jù)蛋白質(zhì)可與考馬斯亮藍G-250 定量結合。當考馬斯亮藍 G-250 與蛋白質(zhì)結合后，其對可見光的大吸收峰從 465nm 變?yōu)?595nm。一般情況，當溶液中的蛋白質(zhì)濃度增加時，顯色液在 595nm 處的吸光度基本能保持線性增加，因此可以用bradford法來測定溶液