簡(jiǎn)述bradford法測(cè)蛋白濃度實(shí)驗(yàn)過程

Bradford法測(cè)蛋白濃度是利用蛋白質(zhì)-染料結(jié)合的原理，定量地測(cè)定微量蛋白質(zhì)濃度的快速靈敏的方法。
Bradford法測(cè)蛋白濃度原理
考馬斯亮藍(lán)(CBB)測(cè)定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種?？捡R斯亮藍(lán)在游離狀態(tài)下呈紅色，大光吸收在488nm;當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌鞍踪|(zhì)—色素結(jié)合物在595nm波長(zhǎng)下有大光吸收。其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比，因此可用于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)結(jié)合在2min左右的時(shí)間內(nèi)達(dá)到平衡，完成反應(yīng)十分迅速;其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。該法試劑配制簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便快捷，反應(yīng)非常靈敏，靈敏度比Lowry法還高4倍，可測(cè)定微克級(jí)蛋白質(zhì)含量，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度范圍為0～1 000μg/ml，bradford法測(cè)蛋白濃度是一種常用的微量蛋白質(zhì)快速測(cè)定方法。
Bradford法測(cè)蛋白濃度試驗(yàn)過程
1、試劑：
（1）考馬斯亮藍(lán)試劑：
考馬斯亮藍(lán)G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，用蒸餾水稀釋1000ml, 濾紙過濾。終試劑中含0.01%（W/V）考馬斯亮藍(lán)G—250, 4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。
（2）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：
純的牛血清血蛋白，根據(jù)其純度同0.15mol/L NaCl配制成100 ug/ml蛋白溶液。
2. 器材： （1）可見光分光光度計(jì) （2）旋渦混合器
3、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
試管編號(hào) 0 1 2 3 4 5 6
100ug/ml標(biāo)準(zhǔn)蛋白（ml） 0.0  0.1 0.2  0.3  0.4  0.5  0.6
0.15mol/L NaCl （ml） 1  0.9  0.8  0.7 0.6  0.5 ? 0.4
考馬斯亮藍(lán)試劑 （ml） 5 5 5 5 5 5 5
搖勻，1h內(nèi)以0號(hào)管為空白對(duì)照,在595nm處比色 
A595nm 
以A595nm為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)（六個(gè)點(diǎn)為10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐標(biāo)軸上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
4、樣品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定
另取兩支干凈的試管（做一重復(fù)），加入合適濃度的待測(cè)樣品，使其測(cè)定值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)，測(cè)定方法同上，由樣品液的吸光度查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可求出含量。
注意事項(xiàng)：
1、如果要求嚴(yán)格，好在試劑加入后的5~20min內(nèi)測(cè)定光 吸收，因?yàn)檫@段時(shí)間內(nèi)顏色是穩(wěn)定的。
2、若選擇在旋渦混合器上混合，注意不要太劇烈，以免產(chǎn)生大量氣泡而難于消除。
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>
用bradford法測(cè)蛋白濃度，測(cè)定未知蛋白質(zhì)濃度樣品的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到蛋白質(zhì)的濃度。配制一組濃度分別為0.10mg/ml，0.08mg/ml，0.06mg/ml，0.04mg/ml，0.02mg/ml，0mg/ml的牛血清蛋白（BSA）溶液，測(cè)定這組溶液的吸光度，得到蛋白質(zhì)濃度對(duì)吸光度的一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)定未知蛋白質(zhì)濃度樣品的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到蛋白質(zhì)的濃度。
二、bradford法測(cè)蛋白濃度實(shí)驗(yàn)過程
1．準(zhǔn)備所需的藥品和儀器。
2．計(jì)算所需配制的溶液的量。
先配制1mg/ml的牛血清蛋白（BSA）母液，再往母液中加入磷酸緩沖溶液（PBS）配制一組濃度分別為1.0mg/ml，0.8mg/ml，0.6mg/ml，0.4mg/ml，0.2mg/ml的BSA溶液，再將這組溶液稀釋10倍，得到一組濃度分別為0.10mg/ml，0.08mg/ml，0.06mg/ml，0.04mg/ml，0.02mg/ml的BSA溶液。計(jì)算*步稀釋各組需要的BSA溶液及PBS溶液的體積。
BSA體積（ul） 100 80 60 40 20
PBS體積（ul） 900 920 940 960 980
BSA濃度（mg/ml） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2
3．具體操作過程。
用天平稱量1.00g牛血清蛋白（BSA），溶于去離子水中，配成100ml的溶液，溶液的濃度為10mg/ml。用移液槍分別取100ul，80ul，60ul，40ul，20ul的BSA溶液，置于1.5ml的EP管中，再分別加入900ul，920ul，940ul，960ul，980ul的磷酸緩沖溶液（PBS）配成1ml的溶液，震蕩使溶液混合均勻。得到一組濃度分別為1.0mg/ml，0.8mg/ml，0.6mg/ml，0.4mg/ml，0.2mg/ml的BSA溶液。
移液槍分別移取100ul剛配好的一組BSA溶液，置于1.5ml的EP管中，各加入900ul的PBS溶液，震蕩使溶液混合均勻。得到一組濃度分別為0.10?mg/ml，0.08mg/ml，0.06mg/ml，0.04mg/ml，0.02mg/ml的BSA溶液。另外量取1ml的PBS溶液（BSA溶液濃度為0?mg/ml）作對(duì)照試驗(yàn)。
用移液槍分別移取50ul配好的一組BSA溶液，滴加到孔板中，再分別加入200ul的考馬斯亮藍(lán)（CBB）。靜置10min后，用酶標(biāo)儀測(cè)得這組BSA溶液的吸光度。
bradford法測(cè)蛋白濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果
通過用Bradford法測(cè)蛋白濃度，得到的吸光度對(duì)BSA濃度的關(guān)系曲線為y=3.09x+0.6807，R2=0.9541?？梢钥闯鑫舛?mdash;濃度的關(guān)系曲線中R2值較小，即測(cè)得的吸光度與濃度的線性不是很好。究其原因可能有以下兩點(diǎn)：一是移液槍的操作不是很熟練，二是移液槍在移液過程中存在著氣泡，使移的液體體積不準(zhǔn)確。