嘌呤霉素篩選細胞的原理

嘌呤霉素(puromycin;PM ) 是一種蛋白質(zhì)合成抑制劑,它具有與tRNA分子末端類似的結(jié)構(gòu)，能夠同氨基酸結(jié)合，代替氨酰化的tRNA同核糖體的A位點結(jié)合，并摻入到生長的肽鏈中。用嘌呤霉素篩選細胞方法如下：
嘌呤霉素篩選細胞
轉(zhuǎn)染（24孔板進行）或電轉(zhuǎn)后培養(yǎng)24小時，按10%密度傳代（傳36mm平皿），繼續(xù)培養(yǎng)24小時，待細胞密度增20%-25%回合時；
去掉培養(yǎng)液，PBS洗一次，加入按照佳嘌呤霉素篩選細胞的濃度（殺傷曲線試驗確定）配制好的嘌呤霉素篩選細胞培養(yǎng)基2-3ml。
根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細胞的存活情況，每隔2天更換一次嘌呤霉素篩選細胞用培養(yǎng)基（培養(yǎng)基用量為2-4ml，細胞多，多家培養(yǎng)基，細胞少，少加培養(yǎng)基），一般在3-1天內(nèi)出現(xiàn)細胞大量或少量死亡情況（如果轉(zhuǎn)染效率或電轉(zhuǎn)效率高，則死亡少；如果轉(zhuǎn)染率或電轉(zhuǎn)率低，則死亡多；如果篩選濃度偏低，嘌呤霉素篩選細胞培養(yǎng)基用量少，細胞密度大于80%，會導致大量假陽性克隆）。如果少選*周，出現(xiàn)細胞大量死亡，則在原培養(yǎng)皿中繼續(xù)加入嘌呤霉素篩選細胞培養(yǎng)基篩選一周；如果刪選*周，出現(xiàn)細胞少量死亡，則把細胞按照10%密度傳代（傳35mm平皿，傳一個皿即可，多余細胞丟棄），利用少選培養(yǎng)基進行篩選一周；
篩選第二周結(jié)束后，則把細胞消化下來。進行重點稀釋（10ul培養(yǎng)基中含1個細胞，用篩選培養(yǎng)基），把上述10ul細胞懸液假日96孔板中（提前加入40ul篩選培養(yǎng)基），伊紅加入24孔，4小時候觀察每個孔的情況。記錄只含一個細胞的孔，含有一個細胞的孔用于繼續(xù)篩選，其余孔舍棄；
根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細胞生長情況換入新的嘌呤霉素篩選細胞用培養(yǎng)基待細胞密度為80%時，將其傳代24孔板中增殖，待細胞密度為80%時，將其傳代6孔板中增殖，待細胞密度為80%時，將其傳代T25瓶（一傳3）中增殖，每隔3天換液。
細胞大量擴增后，一瓶用于提取中RNA進行QPCR檢測，一瓶用于總蛋白進行WB檢測，另一瓶用于保種，根據(jù)QPCR和WB結(jié)果取舍陽性克隆。
嘌呤霉素篩選細胞方法如上，具體的嘌呤霉素篩選細胞讓發(fā)如上，嘌呤霉素穩(wěn)定性高，可以常溫運輸，收到產(chǎn)品后4℃存放；
嘌呤霉素在室溫條件下可存放3個月，4℃條件下保質(zhì)期一年。為了達到理想的穩(wěn)定狀態(tài)和長的保質(zhì)期，好存放于-20°C，保質(zhì)期為2年。