DAPI染DNA的原理及使用方法（包含DAPI配制）

DAPI染DNA的原理及使用方法

DAPI 即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，分子式為C16H15N5·2C3H6O3 ，分子量457.48。

DAPI是一種能夠與DNA強(qiáng)力結(jié)合的熒光染料。它結(jié)合到雙鏈DNA小溝的AT堿基對(duì)處，一個(gè)DAPI分子可以占據(jù)三個(gè)堿基對(duì)的位置。結(jié)合到雙鏈DNA上DAPI分子的熒光強(qiáng)度提高大約20倍，常用與熒光顯微鏡觀測(cè)，根據(jù)熒光的強(qiáng)度可以確定DNA的量。另外，因?yàn)镈API可以透過完整的細(xì)胞膜，它可以用于活細(xì)胞和固定細(xì)胞的染色。

在熒光顯微鏡觀察下，DAPI染劑是利用紫外光波長(zhǎng)的光線激發(fā)。單獨(dú)DAPI的大吸收波長(zhǎng)為340nm，大發(fā)射波長(zhǎng)為488nm；當(dāng)DAPI與雙鏈DNA結(jié)合時(shí)，大吸收波長(zhǎng)為364nm，大發(fā)射波長(zhǎng)為454nm（10 mM Tris pH7.0，100 mM NaCl，10 mM EDTA），其發(fā)散光的波長(zhǎng)范圍含蓋了藍(lán)色青綠色。DAPI也可以和RNA結(jié)合，但產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度只有與DNA結(jié)合的熒光強(qiáng)度的1/5，其發(fā)散光的波長(zhǎng)范圍約在500nm左右。

DAPI的配制及貯存

固體粉末：避光，2-8 ℃保存，3年沒有問題。

貯存液：用無菌水配制成濃度1 mg/ml的貯存液，配好后用錫紙包起來，避光，可在-20 ℃下長(zhǎng)期保存。（DAPI易溶于水，在PBS中溶解度不高）

使用濃度：貯存液用1xPBS稀釋到終濃度100 ng/ml。

熒光封片液：0.5 mol/L碳酸鹽緩沖液與甘油等體積混合，pH9.5

染色與觀察：制好的玻片上滴加幾滴DAPI染液，染色10分鐘，流水沖去染液，濾紙吸除多余水分，加一滴熒光封片液，置于熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)波長(zhǎng)360-400nm。

注意事項(xiàng)：DAPI可能具有致癌性，全部操作過程中必須帶塑料或乳膠手套。