IPTG誘導(dǎo)原理

異丙基-β-D-硫代半乳糖苷,英文名稱IPTG。為安慰性誘導(dǎo)物，X-gal為生色底物，二者共同用于藍(lán)白斑篩選。IPTG可誘導(dǎo)載體lac操縱子DNA區(qū)段合成β-半乳糖苷酶氨基端片段，該片段可與宿主細(xì)胞編碼的缺陷型β-半乳糖苷酶實現(xiàn)基因內(nèi)互補(α互補)。

IPTG誘導(dǎo)原理

先

E.coli的乳糖操縱子（元）含Z、Y及A三個結(jié)構(gòu)基因，分別編碼半乳糖苷酶、透酶和乙?；D(zhuǎn)移酶，此外還有一個操縱序列O、一個啟動序列P及一個調(diào)節(jié)?基因I。I基因編碼一種阻遏蛋白，后者與O序列結(jié)合，使操縱子（元）受阻遏而處于關(guān)閉狀態(tài)。在啟動序列P上游還有一個分解（代謝）物基因激活蛋白（CAP）結(jié)合位點。由P序列、O序列和CAP結(jié)合位點共同構(gòu)成lac操縱子的調(diào)控區(qū)，三個酶的編碼基因即由同一調(diào)控區(qū)調(diào)節(jié)，實現(xiàn)基因產(chǎn)物的協(xié)調(diào)表達(dá)。

其次

在沒有乳糖存在時，lac操縱子（元）處于阻遏狀態(tài)。此時，I序列在PI啟動序列操縱下表達(dá)的Lac阻遏蛋白與O序列結(jié)合，阻礙RNA聚合酶與P序列結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄起動。當(dāng)有乳糖存在時，lac操縱子（元）即可被誘導(dǎo)。在這個操縱子（元）體系中，真正的誘導(dǎo)劑并非乳糖本身。乳糖進(jìn)入細(xì)胞，經(jīng)b－半乳糖苷酶催化，轉(zhuǎn)變?yōu)榘肴樘?。后者作為一種誘導(dǎo)劑分子結(jié)合阻遏蛋白，使蛋白構(gòu)象變化，導(dǎo)致阻遏蛋白與O序列解離、發(fā)生轉(zhuǎn)錄。異丙基硫半乳糖苷（IPTG）是一種作用*的誘導(dǎo)劑，不被細(xì)菌代謝而十分穩(wěn)定，因此被實驗室廣泛應(yīng)用。

IPTG的優(yōu)點

1.能誘導(dǎo)酶的合成，但又不被分解的分子，稱為安慰誘導(dǎo)物。由于乳糖雖可誘導(dǎo)酶的合成，但又隨之分解，產(chǎn)生很多復(fù)雜的動力學(xué)問題，因此人們常用安慰誘導(dǎo)物來進(jìn)行各種實驗。

2.IPTG不被菌體代謝，為乳糖類似物，一旦進(jìn)入細(xì)胞就會產(chǎn)生持續(xù)長久的誘導(dǎo)效果，所以IPTG的誘導(dǎo)效率高，往往只需要很少量(1mmol/L)即可達(dá)到理想誘導(dǎo)效果。由于IPTG不被代謝，在胞內(nèi)專一誘導(dǎo)外源蛋白的表達(dá)。不受細(xì)胞代謝的影響，誘導(dǎo)效果持續(xù)穩(wěn)定。乳糖有雙效作用，既能做為誘導(dǎo)劑異乳糖的前體物質(zhì)，又可以做碳源，在誘導(dǎo)過程中，很不穩(wěn)定，IPTG因其優(yōu)異的穩(wěn)定性決定了它適合做實驗研究用。

3.IPTG能在缺乏lacY基因下而有效地被抄送。

4.半乳糖苷鍵中用硫代替了氧，失去了水解活性，但硫代半乳糖苷和同源的氧代化合物與酶位點的親和力相同，IPTG雖不為β–半乳糖苷酶所識別，但它是lac基因簇十分有效的誘導(dǎo)物。