IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)步驟說明

異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一種作用*的誘導(dǎo)劑，不被細(xì)菌代謝而十分穩(wěn)定，因此被實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用。當(dāng)有乳糖存在時，lac操縱子（元）即可被誘導(dǎo)。在這個操縱子（元）體系中，真正的誘導(dǎo)劑并非乳糖本身。乳糖進(jìn)入細(xì)胞，經(jīng)b－半乳糖苷酶催化，轉(zhuǎn)變?yōu)榘肴樘?。后者作為一種誘導(dǎo)劑分子結(jié)合阻遏蛋白，使蛋白構(gòu)象變化，導(dǎo)致阻遏蛋白與O序列解離、發(fā)生轉(zhuǎn)錄。

材料

1、誘導(dǎo)表達(dá)材料

( 1 ) LB （Luria—Bertani）)培養(yǎng)基酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白胨 (Peptone) 10g

NaCl 10g 瓊脂 (Agar) 1-2%

蒸餾水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0

適用范圍：大腸桿菌

( 2 ) IPTG 貯備液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸餾水中，0 . 22 μm 濾膜過濾除菌，分裝成1 mL /份，－20 ℃ 保存。

( 3 ) l× 凝膠電泳加樣緩沖液：

50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )

50 mmol / L DTT

2 % SDS （電泳級）

0.1 ％ 溴酚藍(lán)

10 ％ 甘油

2、大腸桿菌包涵體的分離與蛋白純化材料

1 ）酶溶法

（1）裂解緩沖液：

50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )

1 mmol / L EDTA

100 mmol / LNaCI

（2）50 mmol / L （PMSF ）。

（3）10 mg / mL 溶菌酶。

（4）脫氧膽酸。

（5）1 mg / mL DNase I。2 ）超聲破碎法

( 1 ) TE 緩沖液。

( 2 ) 2×SDS -PAGE 凝膠電泳加樣緩沖液：

100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 )

100 mmol / L DTT

4 %SDS

0.2 ％ 溴酚藍(lán)

20 ％ 甘油

實(shí)驗(yàn)方案

1、外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)

( 1 ）用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶消化載體DNA 和目的基因。

( 2 ）按連接步驟連接目的基因和載體，并轉(zhuǎn)化到相應(yīng)的宿主菌。

( 3 ）篩選出含重組子的轉(zhuǎn)化菌落，提取質(zhì)粒DNA 作限制性內(nèi)切核酸酶圖譜，DNA 序列測定確定無誤后進(jìn)行下一步。

( 4 ）如果表達(dá)載體的原核啟動子為PL 啟動子，則在30 -32 ℃ 培養(yǎng)數(shù)小時，使培養(yǎng)液的OD600達(dá)0.4-0.6 ，迅速使溫度升42 ℃ 繼續(xù)培養(yǎng)3 -5h ；如果表達(dá)載體的原核啟動子為tac 等，則37 ℃培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)小時達(dá)到對數(shù)生長期后加IPTG 終濃度為1 mmol / L。繼續(xù)培養(yǎng)3 -5h 。

( 5 ）取上述培養(yǎng)液1 mL , 1000g 離心，1 min ，沉淀，加100 μL 聚丙烯酰胺凝膠電泳上樣緩沖液后，作SDS -PAGE 檢測。

2、大腸桿菌包涵體的分離與蛋白質(zhì)純化

1 ）細(xì)菌的裂解

常用方法有：① 高溫珠磨法；② 高壓勻漿；③ 超聲破碎法；④ 酶溶法；⑤ 化學(xué)滲透等。前三種方法屬機(jī)械破碎法，并且方法① 、② 已在工業(yè)生產(chǎn)中得到應(yīng)用，后三種方法在實(shí)驗(yàn)室研究中應(yīng)用較為廣泛。下面介紹酶溶法和超聲破碎法的實(shí)驗(yàn)步驟。

（1）酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶；β-1,3 -葡聚糖酶；β-1,6 -葡聚糖酶；蛋白酶；殼多糖酶；糖昔酶等。溶菌酶主要對細(xì)菌類有作用，而其他幾種酶對酵母作用顯著。

主要步驟為：

① 4 ℃ ，5000rpm 離心，15 min ，收集誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)菌培養(yǎng)液（100 mL ）。棄上清，約每克濕菌加3 mL 裂解緩沖液，懸浮沉淀。

注意事項(xiàng)：培養(yǎng)噬菌體時，Top agar中的添加量為：25 μl/3 ml(24 mg/ml)。含有IPTG的培養(yǎng)基4℃避光保存，須在1~2 周內(nèi)使用。

保存：IPTG要2-8°C冷藏保存，配制好后保存于-20°C，室溫可放置一個月。遠(yuǎn)離熱源及氧化劑