福林酚法測蛋白含量步驟

福林酚法測蛋白含量早是由Lowry確定的測定蛋白質(zhì)濃度的基本方法。以后在生物化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即Folin—酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質(zhì)的靈敏度。

福林酚法測蛋白含量原理：

蛋白質(zhì)與福林酚試劑反應(yīng),生成深藍(lán)色復(fù)合物.藍(lán)色的深淺與蛋白質(zhì)含量成正比.可用分光光度計(jì)于500nm波長下進(jìn)行測定.與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照,而確定蛋白質(zhì)含量.

福林酚法測蛋白含量所需試劑

Folin—酚試劑：

1. 試劑甲

1) 4%碳酸鈉溶液

2) 0.2mol/L氫氧化鈉溶液

3) 1%硫酸銅溶液

4) 2%酒石酸鉀鈉溶液。

臨用前將（1）與（2）等體積配制碳酸鈉—氫氧化鈉溶液。（3）與（4）等體積配制成硫酸銅—酒石酸鉀鈉溶液。然后這兩種試劑按50:1的比例配合，即成Folin—酚試劑甲。此試劑臨用前配制，內(nèi)有效。

2. 試劑乙

稱鎢酸鈉100g，鉬酸鈉25g置2000mL磨口回流裝置內(nèi)，加蒸餾水700mL，85%磷酸50mL和濃硫酸100mL。充分混勻，使其溶解。小火加熱，回流10h（燒瓶內(nèi)加小玻璃珠數(shù)顆，以防溶液溢出），再加入硫酸鋰（LiSO4）150g，蒸餾水50mL及液溴數(shù)滴。在通風(fēng)櫥中開口煮沸15min，以除去多余的溴。冷卻后定容1000mL，過濾即成Folin—酚試劑乙貯存液，此液應(yīng)為鮮黃色，不帶任何綠色。置棕瓶中，可在冰箱長期保存。若此貯存液使用過久，顏色由黃變綠，可加幾滴液溴，煮沸幾分鐘，恢復(fù)原色仍可繼續(xù)使用。

試劑乙貯存液在使用前應(yīng)確定其酸度。以之滴定標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液（1mol/L左右），以酚酞為指示劑，當(dāng)溶液顏色由紅→紫紅→紫灰→墨綠時(shí)即為滴定終點(diǎn)。該試劑的酸度應(yīng)為2mol/L左右，將之稀釋相當(dāng)于1mol/L酸度應(yīng)用。

福林酚法測蛋白含量步驟：

1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：分別吸取0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0ml標(biāo)準(zhǔn)溶液于小試管中,分別加進(jìn)不同量的蒸餾水,補(bǔ)足到1ml.各加入5ml試劑甲,混勻后于室溫下(25℃左右)放置10min.再加入0.5ml試劑乙,立即混勻,于室溫下反應(yīng)30min.于500nm波長下測定光密度.以吸光值作為縱坐標(biāo),蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

2、樣品蛋白質(zhì)含量的測定

取1ml樣品溶液,加入5ml試劑甲,混勻,于25℃左右放置10min.再加入0.5ml試劑乙,立即搖勻,于25℃左右反應(yīng)30min,測定吸光值,從標(biāo)準(zhǔn)曲線查出樣品蛋白質(zhì)含量。

福林酚法測蛋白含量的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多，缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)較長，要嚴(yán)格控制操作時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式，且專一性較差，干擾物質(zhì)較多。