聚丙烯酰胺凝膠電泳原理以及注意事項(xiàng)

聚丙烯酰胺凝膠電泳簡(jiǎn)稱為PAGE（Polyacrylamide?gel?electrophoresis）聚丙烯酰氨凝膠電泳，是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種常用電泳技術(shù)。聚丙烯酰胺凝膠由單體丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺聚合而成，聚合過(guò)程由自由基催化完成。

聚丙烯酰胺凝膠電泳作用：

用于分離蛋白質(zhì)和寡核苷酸。

聚丙烯酰胺凝膠電泳原理：

常用的催化聚合方法有兩種：化學(xué)聚合和光聚合?；瘜W(xué)聚合通常是加入催化劑過(guò)硫酸銨（AP）以及加速劑四甲基乙二胺（TEMED），四甲基乙二胺催化過(guò)硫酸銨產(chǎn)生自由基。溶液的pH對(duì)聚合作用是重要的，因?yàn)檫^(guò)低pH沒(méi)有足夠的堿基加速催化反應(yīng)，同樣過(guò)多的氧分子存在，會(huì)使聚合作用很快停止。所以制備凝膠時(shí)，在加過(guò)硫酸銨之前，混合物必須抽去空氣。核黃素催化的聚合作用，常用于制備濃縮膠，因?yàn)檫@樣制得的凝膠孔度要大些。核黃素在光照射下及有微量氧存在時(shí)，產(chǎn)生自由基使Acr發(fā)生聚合作用。

聚丙烯酰胺凝膠的孔徑可以通過(guò)改變丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的濃度來(lái)控制，丙烯酰胺的濃度可以在3％－30％之間。低濃度的凝膠具有較大的孔徑，如3％的聚丙烯酰胺凝膠對(duì)蛋白質(zhì)沒(méi)有明顯的阻礙作用，可用于平板等電聚焦或SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳的濃縮膠，也可以用于分離DNA；高濃度凝膠具有較小的孔徑，對(duì)蛋白質(zhì)有分子篩的作用，可以用于根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量進(jìn)行分離的電泳中，如10％－20％的凝膠常用于SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳的分離膠。選擇T和C的經(jīng)驗(yàn)公式是：C = 6.5－0.3T此式可用于計(jì)算T為5％～20％時(shí)的凝膠組成。C值并不很嚴(yán)格，在大多數(shù)情況下，可變化的范圍約為 1％，當(dāng)C保持恒定時(shí)，凝膠的有效孔徑隨著T的增加而減小，當(dāng)T保持恒定，C為4％時(shí)，有效孔徑小，C大于或小于4％時(shí)，有效孔徑均變大，C大于5％時(shí)凝膠變脆，不宜使用，實(shí)驗(yàn)中常用的C是2.6％和3％。

聚丙烯酰胺凝膠的優(yōu)點(diǎn)：

1、可以隨意控制膠濃度“T”和交聯(lián)度“C”，從而得到不同的有效孔徑，用于分離不同分子量的生物大分子。( x%

2、能把分子篩作用和電荷效應(yīng)結(jié)合在同一方法中，達(dá)到更高的靈敏度：10－9 ～10－12 mol/L。

3、由于聚丙烯酰胺凝膠是由－C－C－鍵結(jié)合的酰胺多聚物，側(cè)鏈只有不活潑的酰胺基－CO－NH2，沒(méi)有帶電的其他離子基團(tuán)，化學(xué)惰性好，電泳時(shí)不會(huì)產(chǎn)生“電滲”。

4、由于可以制得高純度的單體原料，因而電泳分離的重復(fù)性好。

5、透明度好，便于照相和復(fù)印。機(jī)械強(qiáng)度好，有彈性，不易碎，便于操作和保存。

6、無(wú)紫外吸收，不染色就可以用于紫外波長(zhǎng)的凝膠掃描作定量分析。

7、還可以用作固定化酶的惰性載體。

聚丙烯酰胺膠電泳體系有二種：連續(xù)體系與不連續(xù)體系。前者指整個(gè)電泳體系中所用的緩沖液成分、PH、凝膠網(wǎng)都相同；后者指在電泳體系中采用兩種以上的緩沖液、PH值和孔徑。按電泳裝置不同又可分為垂直管狀(圓盤)電泳和垂直平板電泳。這兩種電泳操作方式基本相同，不同的只是用于凝膠的支架或?yàn)椴ＡЧ?，或?yàn)椴ＡО?。這里以常用的不連續(xù)體系的管型盤狀電泳為例，說(shuō)明凝膠分離蛋白質(zhì)的機(jī)理。