瓊脂糖凝膠電泳條件

瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法.其分析原理與其他支持物電泳的主要區(qū)別是：它兼有“分子篩”和“電泳”的雙重作用。
瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，物質(zhì)分子通過時(shí)會(huì)受到阻力，大分子物質(zhì)在涌動(dòng)時(shí)受到的阻力大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質(zhì)和數(shù)量，而且還取決于分子大小，這就大大提高了分辨能力。但由于其孔徑相當(dāng)大，對大多數(shù)蛋白質(zhì)來說其分子篩效應(yīng)微不足道，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于核酸的研究中。
瓊脂糖凝膠電泳條件
電泳緩沖液的pH在6~9之間，離子強(qiáng)度0.02~0.05為適。瓊脂糖凝膠約可區(qū)分相差100bp的DNA片段，其分辨率雖比聚丙烯酰胺凝膠低，但它制備容易，分離范圍廣。普通瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍為0.2-20kb，利用脈沖電泳，可分離高達(dá)10^7bp的DNA片段。
瓊脂糖凝膠電泳為什么會(huì)形成條帶
瓊脂糖凝膠電泳是基因工程實(shí)驗(yàn)室中分離鑒定核酸的常規(guī)方法.核酸是兩性電解質(zhì),其等電點(diǎn)為pH2-2.5,在常規(guī)的電泳緩沖液中（pH約8.5）,核酸分子帶負(fù)電荷,在電場中向正極移動(dòng).核酸分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí),具有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng),但主要為分子篩效應(yīng).因此,核酸分子的遷移率由下列幾種因素決定：
（1）DNA的分子大小.線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠電泳中的遷移速率與DNA分子量對數(shù)成反比,分子越大則所受阻力越大,也越難于在凝膠孔隙中移動(dòng),因而遷移得越慢.
（2）DNA分子的構(gòu)象.當(dāng)DNA分子處于不同構(gòu)象時(shí),它在電場中移動(dòng)距離不僅和分子量有關(guān),還和它本身構(gòu)象有關(guān).相同分子量的線狀、開環(huán)和超螺旋質(zhì)粒DNA在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)的速度是不一樣的,超螺旋DNA移動(dòng)得快,而開環(huán)狀DNA移動(dòng)慢.如在瓊脂糖凝膠電泳鑒定質(zhì)粒純度時(shí)發(fā)現(xiàn)凝膠上有數(shù)條DNA帶難以確定是質(zhì)粒DNA不同構(gòu)象引起還是因?yàn)楹衅渌鸇NA引起時(shí),可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個(gè)回收,用同一種限制性內(nèi)切酶分別水解,然后電泳,如在凝膠上出現(xiàn)相同的DNA圖譜,則為同一種DNA.
（3）電源電壓.在低電壓時(shí),線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比.但是隨著電場強(qiáng)度的增加,不同分子量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長,片段越大,因場強(qiáng)升高引起的遷移率升高幅度也越大,因此電壓增加,瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小.要使大于2kb的DNA片段的分辨率達(dá)到大,所加電壓不得超過5v/cm.
（4）離子強(qiáng)度影響.電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度影響DNA的電泳遷移率.在沒有離子存在時(shí)（如誤用蒸餾水配制凝膠）,電導(dǎo)率小,DNA幾乎不移動(dòng)；在高離子強(qiáng)度的緩沖液中（如誤加10×電泳緩沖液）,則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱,嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起凝膠熔化或DNA變性.
瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，物質(zhì)分子通過時(shí)會(huì)受到阻力，大分子物質(zhì)在涌動(dòng)時(shí)受到的阻力大，因此在瓊脂糖凝膠電泳中帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質(zhì)和數(shù)量，而且還取決于分子大小，這就大大提高了分辨能力。