瓊脂糖凝膠電泳常見問題

瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂或瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法。對于分子量較大的樣品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔徑較大的瓊脂糖凝膠進行電泳分離。瓊脂糖凝膠電泳常見為題都有哪些？、

一、DNA帶模糊、

1、DNA降解：瓊脂糖凝膠電泳試驗中要避免核酸酶污染

2、電泳緩沖液陳舊：電泳緩沖液多系使用后，離子強度降解，PH值上升，緩沖能力減弱，從而影響電泳實驗，建議經(jīng)常更換電泳緩沖液。

3、所用電泳條件不合適：電泳時電壓不應(yīng)超過20V/cm，溫度<30℃；巨大DNA鏈電泳，溫度應(yīng)該<15℃；檢車所有電泳緩沖液是否有足夠的緩沖能力

4、DNA上揚量過多：應(yīng)減少凝膠中DNA上樣量。

5、DNA樣含鹽量過高：電泳前通過乙醇沉淀去除過多的鹽。

有蛋白污染：電泳前酚抽提去除蛋白

二、不規(guī)則DNA帶遷移

1、對于λ/HindⅢ片段cos位點復(fù)性：電泳前于65℃加熱DNA5分鐘，然后在冰上冷卻5分鐘。

2、電泳條件不合適：電泳電壓不超過20V/cm；溫度<30℃；經(jīng)常更換電泳緩沖液。

3、DNA變性：以20mM NaCI Buffer稀釋DNA，電泳前勿加熱。

三、帶弱或無DNA帶

1、DNA的上樣量不夠：增加DNA的上樣量；聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖凝膠電泳靈敏度稍高，上樣量可適當降低。

2、DNA降解：避免DAN的核酸酶污染

3、DNA走出凝膠：縮短電泳時間，降低電壓，增強凝膠濃度。

4、對于EB染色的DNA，所用光源不合適：應(yīng)用短波長（254mm）的紫外光源

四、DNA帶缺失

1、小DNA帶走出凝膠：縮短電泳時間，降低電壓，增強凝膠濃度。

2、分子大小相近的DNA帶不易分辨：增加電泳時間，核準正確的凝膠濃度。

3、DNA變性：電泳前請勿高溫加熱NDA鏈，以20mM NacI Buffer稀釋DNA

4、DNA鏈巨大，常規(guī)凝膠電泳不合適：在脈沖凝膠電泳上分析。

綜上所述，瓊脂糖凝膠電泳實驗需注意以下幾點：

1.體系配制時候關(guān)鍵的幾個試劑一定要確定它們還有效、或者還沒被污染：引物，酶，超純水。這些東西好自己收好，寫上個人的名字放好，冰盒上記得帶上橡皮筋，這樣就不會因為別人翻冰箱時候把你的冰盒碰散了，試劑都碰掉。否則，你的試劑被污染了，到時候陰性對照狂出條帶，再去找污染源很麻煩。而且配置體系時候要注意保持實驗區(qū)的干凈，事先可用小噴壺進行酒精噴霧，固定空氣中的DNA，而且全程要戴手套，避免污染體系。

2.pcr體系要摸準，好用人家都做得很多的老體系來上手。

3.要想得到漂亮的電泳圖，可以在PCR開始時候就把膠倒上（前提是你的PCR總時間在1.5小時左右，并且1.5小時候之后你還在實驗室。），讓凝膠涼著，這樣凝膠的上樣孔會比較規(guī)則，膠體里面的其本身的孔徑也會較規(guī)則。如果你要第二天再跑膠，千萬記得把PCR完畢的樣本放4℃保存。第二天做時候建議把膠涼上25分鐘左右。

4.瓊脂糖凝膠電泳上樣時候建議使用排槍上樣，不僅快速而且樣本加到膠孔里的速度一致。當然，排槍上樣好選用進口吸頭，國產(chǎn)槍頭就不要想了。

5.不管電泳室使用的頻率高還是低，我都建議每次瓊脂糖凝膠電泳時候更換電泳液，避免出現(xiàn)“＾”形條帶。