培養(yǎng)基的配制與滅菌方法說明

培養(yǎng)基（Medium）是供微生物、植物組織和動物組織生長和維持用的人工配制的養(yǎng)料，一般都含有水、氮源、無機(jī)鹽（包括微量元素）、碳源、生長因子（維生素、氨基酸、堿基、抗菌素、色素、激素和血清等）等。
      不同培養(yǎng)基可根據(jù)實際需要，添加一些自身無法合成的化合物，即生長因子。有些微生物，如自養(yǎng)型微生物，不需要碳源，所以上述物質(zhì)只具有一般性。培養(yǎng)基由于配制的原料不同，使用要求不同，而貯存保管方面也稍有不同。一般培養(yǎng)基在受熱、吸潮后，易被細(xì)菌污染或分解變質(zhì)，因此一般培養(yǎng)基必須防潮、避光、陰涼處保存。對一些需嚴(yán)格滅菌的培養(yǎng)基（如組織培養(yǎng)基），較長時間的貯存，必須放在3-6℃的冰箱內(nèi)。由于液體培養(yǎng)基不易長期保管，均改制成粉末。
培養(yǎng)基的配制
1.配料
      配方換算→在容器中加入少量水（蒸餾水，自然水）→按照配方稱取各種藥品（依次加入）→加足所需水量（一藥一勺，取藥后立即蓋上瓶蓋）。
2.溶解
      淀粉溶解：少量冷水調(diào)成糊狀加熱溶解，特別是加有瓊脂的培養(yǎng)基，一定要煮沸，瓊脂的熔解溫度95-97℃ ，且需要邊加熱邊攪拌以防止燒焦。
3.調(diào)PH
       用1N的鹽酸或1N的 NaOH把培養(yǎng)基調(diào)節(jié)到所要求的值。
4.過濾
       濾紙或棉花進(jìn)行過濾。（有時可以省去）
5.分裝
      一般培養(yǎng)基放在三角瓶或試管中滅菌使用。
(1)三角瓶
      若作靜置培養(yǎng)，則100ml培養(yǎng)基/250ml的三角瓶，多不能超過150ml培養(yǎng)基/250ml的三角瓶，否則滅菌時培養(yǎng)基沸騰容易污染棉塞，造成染菌；若作搖瓶培養(yǎng)，則15-20ml培養(yǎng)基/250ml的三角瓶，保證通氣良好。
(2)試管分裝
      液體培養(yǎng)基一般裝4-5ml，約試管的1/4高度；固體斜面培養(yǎng)基一般裝3-4ml，約試管的1/5高度。
6.包扎
      分裝好后，塞上棉塞，在用牛皮紙將棉塞包裹好，防止滅菌時水份進(jìn)入把棉塞弄濕。
7.滅菌
      按配方上要求的溫度、壓力進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。如果滅菌的溫度太高，營養(yǎng)成分會被破壞，培養(yǎng)基中的糖、氨基酸會使培養(yǎng)基的顏色變深。
8.擺斜面
      滅菌后需要擺斜面的試管要趁熱斜著擺放，使其凝固成為一個斜面，約占試管長度的1/2。
9.貯存
      培養(yǎng)基在30℃下放置，無污染的即可使用。一般用牛皮紙包裹好存放于2-8℃冰箱中備用。
培養(yǎng)基的滅菌
      滅菌是指殺死或消滅一定環(huán)境中的所有微生物，滅菌的方法分物理和化學(xué)滅菌法兩大類。本實驗主要介紹物理方法的一種，即加熱滅菌。
      加熱滅菌包括濕熱和干熱滅菌兩種。通過加熱使菌體內(nèi) 蛋白質(zhì)凝固變性，從而達(dá)到殺菌目的。蛋白質(zhì)的凝固變性與其自身含水量有關(guān)，含水量越高，其凝固所需要的溫度越低。在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，因為在濕熱情況下，菌體吸收水分，使蛋白質(zhì)易于凝固；同時濕熱的穿透力強(qiáng)，可增加滅菌效力。
      濕熱滅菌有煮沸消毒法和高壓蒸汽滅菌法兩種，煮沸消毒法是注射器和解剖器械等均可采用此法。先將注射器等用紗布包好，然后放進(jìn)煮沸消毒器內(nèi)加水煮沸。對于細(xì)菌的營養(yǎng)體煮沸約15～30min，對于芽孢則需煮沸約1～2h。
      高壓蒸汽滅菌法是高壓蒸汽滅菌用途廣，效率高，是微生物學(xué)實驗中常用的滅菌方法。這種滅菌方法是基于水的沸點(diǎn)隨著蒸汽壓力的升高而升高的原理設(shè)計的。當(dāng)蒸汽壓力達(dá)到1.05kg/cm2時，水蒸氣的溫度升高到121℃，經(jīng)15～30min，可全部殺死鍋內(nèi)物品上的各種微生物和它們的孢子或芽孢。一般培養(yǎng)基、玻璃器皿以及傳染性標(biāo)本和工作服等都可應(yīng)用此法滅菌。
培養(yǎng)基注意事項
      1、確認(rèn)工作細(xì)胞庫是否被污染，確認(rèn)毒種工作種子批是否被污染，確認(rèn)所用培養(yǎng)基及其添加成分(如小牛血清、NaHCO3等)是否被污染，均可用細(xì)菌、真菌及支原體無菌試驗來確認(rèn)并排除。同時要對無菌試驗培養(yǎng)基的靈敏度進(jìn)行驗證。實際生產(chǎn)中，可以從配制好的培養(yǎng)液中取少量加入營養(yǎng)瓊脂于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，48小時即可觀察有無污染。
     2、其它：高壓滅菌設(shè)備、過濾除菌設(shè)備均應(yīng)進(jìn)行驗證，確保滅菌和除菌效果;前者應(yīng)在投產(chǎn)前及其后的每6個月進(jìn)行驗證，后者應(yīng)在每次除菌前、后進(jìn)行驗證工作(少應(yīng)在除菌后進(jìn)行一次)。
     3、另外，應(yīng)將有毒區(qū)與無毒區(qū)嚴(yán)格分開，并有各自獨(dú)立的空氣凈化系統(tǒng)及孵室，有毒區(qū)對無毒區(qū)應(yīng)保持相對負(fù)壓，防止病毒對培養(yǎng)細(xì)胞(尤其是細(xì)胞庫)的污染。