western blot的原理及應(yīng)用

Westernblot法即是一種將電泳與KIJSA結(jié)合起來的技術(shù)，可分為電泳、轉(zhuǎn)印、酶免疫測(cè)定3個(gè)階段。Westernblot法結(jié)合了電泳的高分辨率和酶免疫測(cè)定的高敏感性和特異性，是一種能用于分析樣本組分的免疫學(xué)測(cè)定方法。

western blot的作用

與Southern Blot或Northern Blot雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。

Westernblot的應(yīng)用

Westernblot法應(yīng)用分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中時(shí)常會(huì)用到的一種實(shí)驗(yàn)方法，并且是一種能對(duì)蛋白進(jìn)行定性和半定量的分析方法。是通過特異性抗體對(duì)凝膠電泳處理過的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色，并且通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中的表達(dá)情況的信息。

蛋白質(zhì)分析中應(yīng)用的W estern雜交法與DNA分析應(yīng)用的Southern雜交法相似，均是把電流分離的組分從凝膠轉(zhuǎn)移一種固相支持體，并均以針對(duì)特定氨基酸(Westernblot法)或核苷酸(Southern雜交法)序列所制備的特異性樣品作為探針檢測(cè)其相同或相似序列。

對(duì)于蛋白質(zhì)來說，通常使用的探針是抗體，它與附著于固相支持體的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原表位發(fā)生特異性反應(yīng)。Westernblot法的主要優(yōu)點(diǎn)在于，它能夠從生物組織的粗提物或部分純化的粗提物中檢測(cè)和識(shí)別幾種特異的蛋白質(zhì)。將聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS—PAGE)分離的蛋白質(zhì)從聚丙烯酰胺凝膠上通過電轉(zhuǎn)移到一張合適的印跡膜上，隨后用和靈敏檢測(cè)系統(tǒng)相偶聯(lián)的抗體來識(shí)別結(jié)合在膜上的一種或幾種蛋白質(zhì)。這一技術(shù)的靈敏度能達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的固相放射免疫分析的水平而又無需像免疫沉淀法那樣必須對(duì)靶蛋白進(jìn)行放射性標(biāo)記。因此要對(duì)非放射性標(biāo)記蛋白組成的復(fù)雜混合物中的某些特定蛋白進(jìn)行鑒別和定量時(shí)，Westernblot法極為有用。此外，由于蛋白質(zhì)的電泳分離幾乎總在變性條件下進(jìn)行，因此溶解、聚集以及靶蛋白與外來蛋白的共沉淀等諸多問題全都無需加以考慮。