關(guān)于在基因組范圍定位DNA甲基化的新技術(shù)

DNA甲基化在哺乳動(dòng)物基因表達(dá)中扮演了重要角色。盡管通過(guò)線粒體遺傳且隨時(shí)間穩(wěn)定，但是細(xì)胞分化、疾病或環(huán)境影響都會(huì)改變DNA甲基化的模式。近年來(lái)，科學(xué)家們開(kāi)發(fā)出多種新方法，試圖在基因組范圍定位DNA甲基化。

盡管從理論上來(lái)說(shuō)，全基因組亞硫酸氫鹽測(cè)序能讓研究人員全面觀察甲基化組，但它還是面臨技術(shù)以及費(fèi)用上的問(wèn)題。測(cè)序覆蓋通常對(duì)GC含量非常高和非常低的區(qū)域有偏見(jiàn)，即使是在20-40倍覆蓋度，全基因組亞硫酸氫鹽測(cè)序仍不能檢測(cè)出低密度CpG島的某些甲基化差異。

所以盡管更深度測(cè)序是解決方案，但費(fèi)用是主要問(wèn)題。在全基因組亞硫酸氫鹽測(cè)序變得更實(shí)惠之前，研究人員只能采取代表性較低的亞硫酸氫鹽測(cè)序，來(lái)選擇性掃描甲基化組。

有些研究人員采用甲基化DNA免疫沉淀或通過(guò)親和純化的甲基化DNA捕獲，再加上測(cè)序，來(lái)研究感興趣的甲基化區(qū)域。過(guò)去已有研究人員比較了這幾種方法。根據(jù)他們的分析，研究小組發(fā)現(xiàn)每種方法都各有優(yōu)缺點(diǎn)。他們認(rèn)為，MethylCap-seq比MeDIP-seq更好，不過(guò)差異不大，而且也可以優(yōu)化MeDIP-seq，讓它表現(xiàn)更佳。就亞硫酸氫鹽測(cè)序和MethylCap-seq而言，研究人員認(rèn)為后者在基因組覆蓋度上表現(xiàn)更佳，但對(duì)實(shí)驗(yàn)偏差也更為敏感。

于選擇哪一種方法，他們認(rèn)為這在很大程度上取決于樣品和生物問(wèn)題。當(dāng)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展少量或中等數(shù)量樣品的DNA甲基化圖譜分析時(shí)，若DNA量充足，且樣品間質(zhì)量相似，那么可能提供佳的基因組覆蓋度，特別是當(dāng)預(yù)計(jì)的DNA甲基化差異相對(duì)大時(shí)。然而，如果以上條件不滿足，那么亞硫酸氫鹽測(cè)序?qū)⑹歉玫倪x擇，它對(duì)實(shí)驗(yàn)偏差沒(méi)那么敏感，比如批次影響、實(shí)驗(yàn)室間的差異或DNA質(zhì)量不同所引入的差異。

總的來(lái)說(shuō)，他們檢測(cè)的這些方法都很有用，但無(wú)一是全面的，能夠鑒定出樣品中存在的所有DNA甲基化差異。它們一般能更好地鑒定出富含CpG區(qū)域的甲基化差異，而不是CpG較少區(qū)域。對(duì)于有些疾病樣本，珍貴且稀有，無(wú)法用于常規(guī)的分析。于是，一些新方法也不斷涌現(xiàn)而出。

美國(guó)科學(xué)家正在開(kāi)發(fā)一種名為MethylMap的方法，將多重?cái)U(kuò)增、條形碼和單分子亞硫酸氫鹽測(cè)序融合起來(lái)，對(duì)激光捕獲顯微切割的樣品進(jìn)行分析。利用MethylMap，Mitra的小組計(jì)劃對(duì)多種癌癥患者的腫瘤樣本及周圍組織進(jìn)行鑒定。他表示，開(kāi)發(fā)這項(xiàng)技術(shù)主要是為了了解甲基化在腫瘤發(fā)展中的作用。他相信MethylMap有望應(yīng)用于臨床，這種分析少量細(xì)胞中全基因組范圍甲基化的能力還可能鑒定出疾病的生物標(biāo)志物。

同時(shí)也有研究小組也致力于小規(guī)模的表觀遺傳學(xué)變化分析。他們正在開(kāi)發(fā)一種基于納米流體學(xué)的技術(shù)，有望檢測(cè)出單分子水平的甲基化差異。此技術(shù)名為SCAN，意為納米規(guī)模的單染色體分析。

從原理上來(lái)看，它類似于流式細(xì)胞儀。流式細(xì)胞儀是處理整個(gè)細(xì)胞，而SCAN是處理染色體片段。當(dāng)然，前者是利用細(xì)胞表面標(biāo)志物的抗體，而后者是利用組蛋白和組蛋白變異體的抗體以及識(shí)別甲基化DNA的蛋白。利用SCAN，研究人員通過(guò)電壓梯度驅(qū)動(dòng)單個(gè)標(biāo)記分子在納米通道中流動(dòng)，當(dāng)分子穿過(guò)某一點(diǎn)時(shí)，利用激光誘導(dǎo)的熒光共聚焦顯微鏡進(jìn)行成像。由于他們要觀察的是單個(gè)分子，而不是單個(gè)細(xì)胞，所以他們需要的靈敏度也要比細(xì)胞分選要高得多。

他們正在優(yōu)化SCAN平臺(tái)的通量，并不斷改造，希望終能運(yùn)行多個(gè)平行的納米流體通道。研究小組還希望在SCAN平臺(tái)上增加分選功能，像流式細(xì)胞儀一樣，具有分析和制備兩種功能。