胰糜蛋白酶的制備

胰糜蛋白酶的制備 
【實驗?zāi)康摹?nbsp; ：掌握從組織中制備胰糜蛋白酶的原理和方法。 
【實驗原理】  ：胰糜蛋白酶是胰腺產(chǎn)生的一種消化酶。初以酶原的形式被合成與分泌，之后在胰蛋白酶的作用下被水解而激活。胰糜蛋白酶是一種催化肽鍵的肽鏈內(nèi)切酶，主要切斷色氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸的羧基側(cè)肽鍵。 
酶絕大多數(shù)都是蛋白質(zhì)，因此一般提純蛋白質(zhì)的方法也適用于酶的提純，所不同的是在提純酶的過程中要不斷地進(jìn)行酶活力的檢測，本實驗主要涉及提取過程。 
【實驗藥品與器材】 
（一）材料和試劑 
1.主要材料：新鮮豬胰臟1個。 
2.主要試劑： 
2.5mol/LH2SO4溶液，固體（NH4）2SO4，氯化鈣粉，1%酪蛋白溶液，）0.1mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液，1％BaCl2溶液，5mol/LNaOH溶液。 
（二）主要器材 
組織搗碎機、手術(shù)器械、紗布、漏斗、透析袋、離心機、燒杯、pH計、離心管。 
【實驗方法與步驟】 
1.提取取新鮮豬胰臟，放在盛有冰冷2.5mol/LH2SO4溶液的容器中，保存在冰箱中待用。去除胰臟表面的脂肪和結(jié)締組織后，稱重。用組織搗碎機粉碎。然后混懸于兩倍體積的冰冷2.5mol/LH2SO4溶液中，置于冰箱中過夜。將上述混懸液以3000rpm離心10min，上層液經(jīng)兩層紗布過濾燒杯中；將沉淀再混懸于等體積的冰冷2.5mol/LH2SO4溶液中，再離心，將兩次上層液合并，即為提取液。此時可留樣測酶的活力。 
2.分離。 
3.結(jié)晶取分離所得的胰糜蛋白酶溶于3倍體積的水中（此時可取0.5ml留樣測酶活力），加（NH4）2SO4（1.44g/10ml），用5mol/LNaOH溶液調(diào)pH6.0，在室溫放置12h即可出現(xiàn)結(jié)晶，在顯微鏡下觀察結(jié)晶形狀。 
【注意事項】 
1.整個操作過程在0℃～5℃條件下進(jìn)行。 
2.實驗材料應(yīng)采用新鮮胰組織。 
3.分清實驗過程中每次離心后各保留的是上清液，還是沉淀。 
4.離子強度、pH、溫度、試管的潔凈度等均可影響酶的活性，如需進(jìn)一步進(jìn)行活性測定，務(wù)必保證固定的實驗條件，嚴(yán)格按照程序操作。