線粒體復(fù)合體 Ⅳ 試劑盒

線粒體復(fù)合體 Ⅳ 試劑盒說明書
產(chǎn)品簡介 ：
線粒體復(fù)合體Ⅳ又稱細胞色素 C 氧化酶，也是線粒體呼吸電子傳遞鏈主路和支路的共有成分，負責(zé)催
化還原型細胞色素 C 的氧化，并終把電子傳遞給氧，生成水。
還原型細胞色素 C 在 550nm 有特征光吸收，線粒體復(fù)合體Ⅳ催化還原型細胞色素 C 生成氧化型細胞色
素 C，因此 550nm 光吸收下降速率能夠反映線粒體復(fù)合體Ⅳ酶活性。
試驗中所需的儀器和試劑：
可見分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
產(chǎn)品內(nèi)容 ：
試劑一：25 mL×1 瓶，-20℃保存；
試劑二：5 mL×1 瓶，-20℃保存；
試劑三：0.5 mL×1 瓶，-20℃保存；
試劑四：液體 10 mL×2 瓶，4℃保存；
試劑五：粉劑×2 支，-20℃保存；
試劑六：粉劑×2 支，-20℃保存；
工作液的配制：臨用前取試劑四、試劑五、試劑六各一支，將試劑五和試劑六依次轉(zhuǎn)移到試劑四中混合
溶解。分批配制工作液是為了防止當(dāng)天不能測完，導(dǎo)致工作液失敗。
操作步驟 ：
一 、 線粒體 復(fù)合體 Ⅳ 的提取 ：
(1) 準確稱取 0.1g 組織或收集 500 萬細胞，加入 1mL 試劑一和 10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
(2) 將勻漿 4℃ 600g 離心 5min。
(3) 將上清液轉(zhuǎn)移另一離心管中，4℃ 11000g 離心 10min。
(4) 上清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄露的復(fù)合體Ⅳ（此步可選做）。
(5) 在沉淀中加入 200uL 試劑二和 2uL 試劑三，超生波破碎（功率 20%，超聲 3 秒，間歇 10 秒，重復(fù) 30
次），用于復(fù)合體Ⅳ酶活性測定，并且用于蛋白含量的測定。
二 、 測定 步驟 ：
1. 調(diào)零
用蒸餾水于 550nm 處調(diào)零
2. 樣本測定
(1) 取 800uL 工作液加入 1mL 玻璃比色皿中，在 37℃（哺乳動物）或 25℃（其他物種）孵育 5min。
(2) 取出比色皿，加入 40uL 樣本，混勻，立即記錄 550nm 處初始吸光值 A1，37℃（哺乳動物）或 25℃（其
他物種）中準確反應(yīng) 1min，記錄 550nm 處 1min 后的吸光值 A2，計算 ?A=A1-A2。
注意：
若 A1-A2 大于 0.2，需將樣本用試劑二稀釋適當(dāng)倍數(shù)，使 A1-A2 小于 0.2，可提高檢測靈敏度。
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復(fù)合體 Ⅳ 活?單位的計算 ：
1 、 組織中 復(fù)合體 Ⅳ 活力的計算:
(1)按樣本蛋白濃度計算
單位定義：每 mg 組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化降解 1nmol 還原型細胞色素 C 定義為一個酶活力單位。
復(fù)合體Ⅳ活力（U/mg prot）=反應(yīng)總體積（840µL）÷樣本體積（40µL）÷反應(yīng)時間(1min)÷細胞色素 C 消光
系數(shù)（19.1×10 -3 ）×?A÷蛋白濃度（mg/mL）=1099×?A ÷蛋白濃度（mg/mL）
(2)按樣本鮮重計算
單位定義：每 g 組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化降解 1nmol 還原型細胞色素 C 定義為一個酶活力單位。
復(fù)合體Ⅳ活力（U/g 鮮重）=反應(yīng)總體積（840µL）÷樣本體積（40µL）÷反應(yīng)時間(1min)÷細胞色素 C 消光系
數(shù)（19.1×10 -3 ）×?A÷樣本鮮重（g/mL）=1099×?A ÷樣本鮮重（g/mL）
2 、 細菌或細胞中 復(fù)合體 Ⅳ 活力的計算:
(1)按樣本蛋白濃度計算
單位定義：每 mg 組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化降解 1nmol 還原型細胞色素 C 定義為一個酶活力單位。
復(fù)合體Ⅳ活力（U/mg prot）=反應(yīng)總體積（840µL）÷樣本體積（40µL）÷反應(yīng)時間(1min)÷細胞色素 C 消光
系數(shù)（19.1×10 -3 ）×?A÷蛋白濃度（mg/mL）=1099×?A÷蛋白濃度（mg/mL）
(2)按細菌或細胞密度計算
單位定義：每 1 萬個細菌或細胞在反應(yīng)體系中每分鐘催化降解 1nmol 還原型細胞色素 C 定義為一個酶活力
單位。
復(fù)合體Ⅳ活力（U/10 4 cell）=反應(yīng)總體積（840µL）÷樣本體積（40µL）÷反應(yīng)時間(1min)÷細胞色素 C 消光系
數(shù)（19.1×10 -3 ）×?A÷細菌或細胞密度（10 4 /mL）=1099×?A÷細菌或細胞密度（10 4 /mL）