小鼠CXC趨化因子配體5ELISA試劑盒

小鼠CXC趨化因子配體5ELISA試劑盒背景介紹： 

小鼠 LIX（脂多糖（LPS）誘導的 CXC 趨化因子），也稱為GCP-2，是CXCL細胞因子家族中 7-9 kDa 中性粒細胞和單核細胞趨化蛋白的 ELR 組的成員。 小鼠 LIX cDNA 編碼 132 個 AA，包括 40 個 AA 信號 肽和多達 92 個 AA 成熟蛋白，其 C-末端的長度比其他 ELR 細胞因子長。成熟的 LIX 的前 78 個 AA 分別與 人類 CXCL6/GCP-2 和 CXCL5/ENA -78 共有 63%和 55% AA 同源性。其活性與這些人趨化因子相似但不完 全相同。在小鼠中，CXCL1/KC 和 CXCL2/MIP-2 的表達和功能可能與 LIX 重疊。 LIX 可由多種細胞產(chǎn)生，包括成纖維細胞、上皮細胞（包括肺泡 II 型上皮）、內(nèi)皮細胞、血小板、心 肌細胞、成骨細胞、少突膠質(zhì)細胞和脂肪駐留的巨噬細胞。它主要是由 LPS、IL-17 和/或 TNF-α誘導產(chǎn)生的。 LIX 也可以儲存在特定的顆粒內(nèi)，如血小板α顆粒和內(nèi)皮胞質(zhì)顆粒。內(nèi)毒素血癥增加 LIX 表達，特別是在心 臟，但也在肺，脾，肝。LIX 是較有效的小鼠中性粒細胞趨化因子和激活劑。LIX 參與 LPS 誘導的急性肺損 傷和肺缺血誘導的血管生成，它在炎癥性骨丟失中起保護作用。 

檢測原理：

Solarbio (Solarbio ®) ELISA 試劑盒采用基于雙抗體夾心法的酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)。將抗小鼠 LIX/CXCL5 單克隆抗體包被在酶標板上；分別加入梯度稀釋的標準品和預(yù)稀釋的樣本，標準品和樣本中的 小鼠 LIX/CXCL5 會與酶標板上的包被抗體充分結(jié)合；洗板后加入生物素化抗小鼠 LIX/CXCL5 抗體，該抗 體會與板子上包被抗體捕獲的標準品和樣本中的小鼠 LIX/CXCL5 發(fā)生特異性結(jié)合；洗板后加入辣根過氧化 物酶（HRP）標記的鏈霉親和素，生物素與鏈霉親和素會發(fā)生高強度的非共價結(jié)合；洗板后加入顯色劑底 物 TMB，若反應(yīng)孔中樣品存在不同濃度的小鼠 LIX/CXCL5 ，則 HRP 會使無色 TMB 變成不同深淺（正相 關(guān)）的藍色物質(zhì)，加入終止液后反應(yīng)孔會變成黃色；后，在λmax=450 nm（OD=450 nm）處測定反應(yīng)孔樣 品吸光度（OD），樣本中的小鼠濃度與 OD 成正比，通過繪制標準曲線和四參數(shù)擬合軟件便可計算出樣本 中小鼠的濃度。

注意事項：

1. 試劑盒應(yīng)在有效期內(nèi)使用,請不要使用過期的試劑。

2. 試劑盒未使用時應(yīng)保存在 2-8℃冰箱,已復(fù)溶但未用完的標準品,請丟棄。

3. 試劑盒使用前請在室溫恢復(fù) 30 min,且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品。

4. 在試驗中標準品和樣本建議作復(fù)孔檢測,且加入試劑的順序應(yīng)保持*。

5. 為避免交叉污染,請在試驗中使用 1 次性試管,槍頭,封板膜（※）及潔凈塑料容器。

6. 濃縮生物素化抗體和濃縮酶結(jié)合物的體積較少,在運輸過程中微量液體會沾到管壁及瓶蓋上,使用前請離心處理（5-10 S 即可）,使管壁上的液體集中在管底部,取用時,請用移液器小心吹打幾次。

7. 除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外,請不要使用其他來源試劑盒內(nèi)含的試劑代替本試劑盒中的某單個組分。

8. 為保證結(jié)果準確,每次檢測均需做標準曲線。

安全提示：

試劑盒中的終止液為酸性溶液,操作小鼠員在使用時請帶上手套并注意防護；在操作過程中也要避免試劑接觸皮膚和眼睛,如果不慎接觸,請用大量清水清洗；檢測血液樣本及其它體液樣本時,請按國家生物實驗室安全防護有關(guān)管理規(guī)定執(zhí)行。

自備實驗器材（不提供,可代購）：

1． 酶標儀（主波長 450nm,參考波長 630nm）

2． 高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl

3． 洗板機或洗瓶

4． 37℃孵育箱

5． 雙蒸水,去離子水,量筒等

6． 稀釋用聚丙烯試管

小鼠CXC趨化因子配體5ELISA試劑盒樣本收集及儲存：

1. 細胞培養(yǎng)上清：將細胞培養(yǎng)基移無菌離心管,在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min,然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存）,避免反復(fù)凍融。

2. 血清樣本：室溫血液自然凝固20 min后,在4℃條件下1000×g離心10 min,然后將上清等量分裝于小EP管并于-20℃下保存（24 小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存）,保存過程中如有沉淀,請再次離心,避免反復(fù)凍融。

3. 血漿樣本：將全血收集到含抗血凝劑的管中,根據(jù)標本的實際要求選擇 EDTA,檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑,混合 20min,在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min,然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存）,避免反復(fù)凍融。 ?

注意：血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本,以免影響檢測結(jié)果；如果樣本中的靶標物檢測濃度高于標準品的值,請將樣品做適當倍數(shù)稀釋后檢測,建議正式實驗前做預(yù)實驗以確定稀釋倍數(shù)。 

試劑準備：

?1. 試劑回溫：首先在實驗前 30 min 將試劑盒，待測樣本放置于室溫下，濃縮洗滌液如出現(xiàn)結(jié)晶，請放入37℃溫浴直到結(jié)晶全部溶解。

2. 配制洗滌液：預(yù)先計算好稀釋后的洗滌液使用體積，然后用雙蒸水或去離子水將 20 倍濃縮洗滌液稀釋成 1 倍應(yīng)用液，未用完的濃縮洗滌液放入 4℃冰箱保存。

3. 標準品梯度稀釋：加入標準品/樣本稀釋液（SR1）1000?L凍干標準品中，靜置15分鐘待其*溶解后輕輕混勻(濃度為2000pg/ml)，按照以下濃度進行2倍稀釋：2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、0pg/ml進行稀釋。2000pg/ml作為標準曲線的點濃度，標準品/樣本稀釋液（SR1）作為標準曲線的零點（0pg/ml）。復(fù)溶過的標準品原液（2000pg/ml）未用完的應(yīng)廢棄或根據(jù)需要按照一次用量分裝，并將其貯存在-20～-80℃冰箱，具體如下圖。

4. 生物素化抗體工作液：預(yù)先計算好試驗所需用量，用檢測稀釋液（SR2）將100倍抗體濃縮液稀釋成1倍應(yīng)用工作液（稀釋前充分混勻），請在30分鐘內(nèi)加入到反應(yīng)孔中。

5. 酶結(jié)合物工作液：按每次試驗所需用量配制，用酶結(jié)合物稀釋液（SR3）將100倍濃縮酶結(jié)合物稀釋成1倍應(yīng)用工作液（稀釋前離心），請在30分鐘內(nèi)使用。

6. 洗滌方法：

?自動洗板：甩盡酶標板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，注入洗滌液為 300ul/孔,注與吸出間隔為 30 秒，洗板 5 次。

? 手工洗板：甩盡酶標板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，用洗瓶加入洗滌液 300ul/孔，靜止30 秒后甩凈酶標板孔中液體，在厚迭的吸水紙上拍干，洗板 5 次。

小鼠CXC趨化因子配體5結(jié)果判斷：

1.用酶標儀 450 nm 波長測定 OD 值。選擇雙波長檢測，參考波長為 630 nm。如不能進行雙波長檢測，請用 450 nm 的 OD 測定值減去 630 nm 的 OD 測定值。

2.計算標準品、樣品的平均 OD 值：每個標準品和標本的 OD 值應(yīng)減去零孔的 OD 值。

3.以標準品濃度為橫坐標，吸光度OD值為縱坐標，用軟件繪制標準曲線，樣品中含量可通過對應(yīng)OD值由標準曲線換算出相應(yīng)的濃度。

4.若標本 OD 值高于標準曲線上限，應(yīng)做適當稀釋后重新檢測，計算濃度時再乘以稀釋倍數(shù)。

2. 靈敏度：低可檢測小鼠濃度達 15pg/ml，20 個零標準品濃度 OD 的平均值加上兩個標準差，計算相應(yīng)的可檢測濃度。

3. 特異性：不與小鼠 CXCL1/KC、CXCL2/MIP-2,人的 CXCL5/ENA-78、CXCL6/GCP-2，大鼠的 LIX 等反應(yīng)。

4. 重復(fù)性：板內(nèi)，板間變異系數(shù)<10%。

5. 回收率：在選取的健康小鼠血漿、細胞培養(yǎng)上清中加入 3 個不同濃度水平的小鼠 ，計算回收率

6. 線性稀釋：分別在選取的 4 份健康小鼠血漿和細胞培養(yǎng)上清中加入高濃度小鼠 ，在標準曲線動力學范圍內(nèi)進行稀釋，評估線性。

小鼠CXC趨化因子配體5酶聯(lián)免疫試劑盒