乙醇脫氫酶(ADH)活性檢測(cè)試劑盒 微量法

乙醇脫氫酶（ADH）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)
微量法
注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng)，請(qǐng)注意并嚴(yán)格按照該說(shuō)明書(shū)操作。
貨號(hào)：BC1085
規(guī)格：100T/96S
產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 提取液：臨用前將粉劑一倒入提取液中，溶液為懸濁液，使用前需搖勻；

2. 試劑二：臨用前取1支試劑二加入1mL蒸餾水，可以-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融。1支即可做100T，為延長(zhǎng)試劑盒使用時(shí)間，遂多給一支。

產(chǎn)品說(shuō)明：
ADH是生物體內(nèi)短鏈醇代謝的關(guān)鍵酶，催化乙醇與乙醛可逆轉(zhuǎn)換，在很多生理過(guò)程中起著重要作用。哺乳動(dòng)物ADH主要在肝臟生成，肝臟損傷導(dǎo)致ADH釋放到血清中。血清ADH活性高低反映了肝功能是否異常。
ADH催化NADH還原乙醛生成乙醇和NAD⁺，NADH在340nm處有吸收峰，而NAD⁺沒(méi)有；測(cè)定340nm 吸光度下降速率，來(lái)計(jì)算ADH活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。
需自備的儀器和用品：
冰、低溫離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、可調(diào)式移液器、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）
1、 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿。16000g，4℃離心20min，取上清置冰上待測(cè)。
2、 細(xì)菌、細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300W，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；16000g，4℃離心20min，取上清液置冰上待測(cè)。

3、血清等液體：直接測(cè)定。
二、測(cè)定步驟

1. 紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到340nm，紫外分光光度計(jì)用蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑一在25℃水浴中保溫30min以上。

3. 空白管：在微量石英比色皿//96孔板（UV板）中依次加入20μL蒸餾水、8μL試劑二、152μL試劑一和20μL試劑三，迅速混勻后于340nm測(cè)定吸光值變化，分別記錄15s和75s時(shí)吸光值，分別記為A1和A2。ΔA空白管=A1-A2。（空白管只需做1~2個(gè)）

4. 測(cè)定管：在微量石英比色皿//96孔板（UV板）中依次加入20μL上清液、8μL試劑二、152μL試劑一和20μL試劑三，迅速混勻后于340nm測(cè)定吸光值變化，分別記錄15s和75s時(shí)吸光值，分別記為A3和A4。ΔA測(cè)定管=A3-A4。

三、ADH活性計(jì)算
a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
（1）按蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1μmol NADH為1個(gè)酶活單位。
ADH (U/mg prot) =[(ΔA測(cè)定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反總×10⁶]÷(Cpr×V樣)÷T
              =1.61×(ΔA測(cè)定管–ΔA空白管) ÷Cpr
（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算
活性單位定義：25℃中每克組織每分鐘氧化1μmol NADH為1個(gè)酶活單位。
ADH (U/g 質(zhì)量) =[(ΔA測(cè)定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反總×10⁶] ÷(W×V樣÷V樣總)÷T
              =1.61×(ΔA測(cè)定管–ΔA空白管)÷W
（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
活性單位定義：25℃中每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化1μmol NADH為1個(gè)酶活單位。
ADH (U /10⁴ cell) = [(ΔA測(cè)定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反總×10⁶]÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T
=1.61×(ΔA測(cè)定管–ΔA空白管) ÷細(xì)胞數(shù)量
（4）按液體體積計(jì)算
活性單位定義：25℃中每毫升樣本每分鐘氧化1μmol NADH為1個(gè)酶活單位。
ADH (U/mL) = [(ΔA測(cè)定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反總×10⁶]÷V樣÷T=1.61×(ΔA測(cè)定管–ΔA空白管)
ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，200μL=2×10^-4L；10⁶：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1mol=1×10⁶μmol；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=0.02mL；V樣總：提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1min；細(xì)胞數(shù)量：以萬(wàn)計(jì)。
b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
（1）按蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1μmol NADH為1個(gè)酶活單位。
ADH (U/mg prot) =[(ΔA測(cè)定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反總×10⁶]÷(Cpr×V樣)÷T
               =2.68×(ΔA測(cè)定管–ΔA空白管) ÷Cpr
（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算
活性單位定義：25℃中每克組織每分鐘氧化1μmol NADH為1個(gè)酶活單位。
ADH (U/g 質(zhì)量) =[(ΔA測(cè)定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反總×10⁶]÷(W×V樣÷V樣總)÷T
              =2.68×(ΔA測(cè)定管–ΔA空白管)÷W



（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
活性單位定義：25℃中每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化1μmol NADH為1個(gè)酶活單位。
ADH (U/10⁴ cell) = [(ΔA測(cè)定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反總×10⁶]÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T
  =2.68×(ΔA測(cè)定管–ΔA空白管) ÷細(xì)胞數(shù)量
（4）按液體體積計(jì)算
活性單位定義：25℃中每毫升樣本每分鐘氧化1μmol NADH為1個(gè)酶活單位。
ADH (U/mL) = [(ΔA測(cè)定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反總×10⁶]÷V樣÷T=2.68×(ΔA測(cè)定管–ΔA空白管)
ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.6cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，200μL=2×10^-4L；10⁶：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1mol=1×10⁶μmol；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，需要自行測(cè)定；W：樣本質(zhì)量，g；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=0.02mL；V樣總：提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1min；細(xì)胞數(shù)量：以萬(wàn)計(jì)。
注意事項(xiàng)：

1. 若A3大于1.5或者A3小于A1，則需要將樣本用蒸餾水稀釋再進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算公式注意乘以稀釋倍數(shù)。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 取0.1g大鼠肝臟加入1mL提取液進(jìn)行勻漿研磨，取上清后按照測(cè)定步驟操作，用微量石英比色皿測(cè)得計(jì)算ΔA空白管=A1-A2=0.5718-0.5648=0.007，ΔA測(cè)定管=A3-A4=0.8351-0.5341=0.301，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

ADH (U/g 質(zhì)量) =1.61×(ΔA測(cè)定管–ΔA空白管)÷W=1.61×(0.301-0.007)÷0.1=4.7334 U/g 質(zhì)量。

1. 取馬血清直接檢測(cè)，用微量石英比色皿測(cè)得計(jì)算ΔA空白管=A1-A2=0.5718-0.5648=0.007，ΔA測(cè)定管=A3-A4=0.6369-0.6036=0.0333，按液體體積計(jì)算酶活得：

ADH ((U/mL) =1.61×(ΔA測(cè)定管–ΔA空白管)=1.61×(0.0333-0.007)=0.042343 U/mL。

1. 取小鼠血漿直接檢測(cè)，用微量石英比色皿測(cè)得計(jì)算ΔA空白管=A1-A2=0.5718-0.5648=0.007，ΔA測(cè)定管=A3-A4=0.7381-0.7093=0.0288，按液體體積計(jì)算酶活得：

ADH (U/mL) =1.61×(ΔA測(cè)定管–ΔA空白管)=1.61×(0.0288-0.007)=0.035098 U/mL。
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