葡萄糖脫氫酶（GCDH)檢測試劑盒 微量法

葡萄糖脫氫酶（GCDH）活性檢測試劑盒說明書
微量法
貨號：BC2695
規(guī)格：100T/96S
產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二：臨用前加入7.5 mL試劑一溶解，用不完的試劑2-8℃保存8周；

2. 試劑三：臨用前每瓶加入5 mL試劑一溶解，用不完的試劑建議分裝后-20℃避光可保存4周；

3. 工作液的配制：按照試劑一：試劑二：試劑三為4：3：2的體積比例充分混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配，用前37℃預(yù)熱10 min。

產(chǎn)品說明：
GCDH（EC 1.1.1.47）催化D-葡萄糖和NAD(P)生成D-葡萄糖酸和NAD(P)H，主要存在于多種微生物和高等動物的肝臟中。GCDH是一種制備高含量低聚果糖的理想用酶，同時也是臨床血糖測定的診斷用酶，可廣泛用于食品工業(yè)及醫(yī)藥工業(yè)領(lǐng)域中。
GCDH催化D-葡萄糖和NAD生成D-葡萄糖酸和NADH，利用NADH在340nm處吸光值的變化即可反映葡萄糖脫氫酶的活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式低溫離心機(jī)、水浴鍋、微量石英比色皿/96孔UV板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟：具體操作步驟詳見“產(chǎn)品資料"附件
一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）
組織：按照組織質(zhì)量（g）︰提取液體積(mL)為1︰5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后，8000g，4℃，離心10 min，取上清置于冰上待測。
細(xì)胞或細(xì)菌：先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）︰提取液體積（mL）為500~1000︰1的比例（建議500萬個細(xì)胞或細(xì)菌加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞或細(xì)菌（功率200 W，超聲3s，間隔7s，總時間5min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。
血清（漿）：直接檢測。
二、測定步驟

1. 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 操作表：在微量石英比色皿/96孔UV板中分別加入下列試劑：

• GCDH酶活計算

A、按微量石英比色皿計算：

1. 按樣本蛋白濃度計算

酶活定義：每毫克蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
GCDH酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（V樣×Cpr）÷T=1607.7×ΔA÷Cpr

1. 按樣本質(zhì)量計算

酶活定義：每克樣本每分鐘產(chǎn)生1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
GCDH酶活（U/g質(zhì)量）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T =1607.7×ΔA÷W

1. 按細(xì)胞或細(xì)胞數(shù)量計算

酶活定義：每10⁴個細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
GCDH酶活（U/10⁴ cell）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量（萬個））÷T
=1607.7×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量（萬個）

1. 按液體體積計算

酶活定義：每mL樣本每分鐘產(chǎn)生1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
GCDH酶活（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷V樣÷T=1607.7×ΔA
ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/ mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；10⁹：單位換算系數(shù)，1mol=10⁹nmol；V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4L；V樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，1min。
B、按96孔UV板計算：
將上述公式中的d-1cm改為d-0.6cm（96孔板光徑）進(jìn)行計算即可。
注意事項：

1. 樣本提取上清液置于冰上待測，且樣本提取完成后建議當(dāng)天提取當(dāng)天內(nèi)測完。

2. 當(dāng)A1或A2大于1.7時，建議將樣本用提取液稀釋后再進(jìn)行測定。

3. 當(dāng)ΔA大于1.5時，建議將樣本用提取液稀釋后再進(jìn)行測定。

實驗實例：

1. 取0.1g肝臟加入1mL提取液進(jìn)行勻漿研磨，取上清后按照測定步驟操作，使用微量石英比色皿測得計算ΔA測定管=A2測定-A1測定=0.5806-0.5291=0.0515，ΔA空白管=A2空白-A1空白=0.0294-0.0294=0，ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管=0.0515-0=0.0515，按樣本質(zhì)量計算酶活得：GCDH酶活（U/g質(zhì)量）=1607.7×ΔA÷W =1607.7×0.0515÷0.1=827.966U/g 質(zhì)量。

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