轉(zhuǎn)氫酶-2活性檢測(cè)試劑盒 微量法

轉(zhuǎn)氫酶-2（TH-2）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書
微量法
貨號(hào)：BC3265
規(guī)格：100T/48S
產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑一：臨用前取1瓶加入3mL試劑三。用不完的試劑-20℃分裝保存2周，避免反復(fù)凍融。

2. 試劑二：臨用前取1瓶加入10 mL試劑三備用。用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融。（1瓶粉劑溶解可做100T，為了延長(zhǎng)使用時(shí)間，此產(chǎn)品多給1瓶粉劑）

產(chǎn)品說(shuō)明：
轉(zhuǎn)氫酶位于線粒體的內(nèi)膜上，又稱為線粒體復(fù)合體六，催化NADH+NADP⁺和NAD⁺+NADPH相互轉(zhuǎn)化，調(diào)節(jié)線粒體NAD(H)和NADP(H)平衡。把逆向反應(yīng)稱為TH-2，催化NADPH和NAD⁺生成NADP⁺和NADH。
NADH和NADPH均在340nm有特征吸收，因此TH催化的轉(zhuǎn)氫反應(yīng)不能導(dǎo)致340nm吸光度發(fā)生變化。用人工合成底物3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸（APAD⁺）替代NAD⁺，TH-2催化APAD⁺還原生成APADH，APADH在375nm有特征光吸收，測(cè)定375nm光吸收的增加速率，來(lái)計(jì)算TH-2活性。
注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。

操作步驟：具體操作步驟詳見(jiàn)“產(chǎn)品資料"附件

注意事項(xiàng)：

1. 如果測(cè)定的吸光值過(guò)高（高于1.5）或者ΔA大于0.25時(shí)，可用提取液或試劑三稀釋上清液后再測(cè)定。

2. 樣本蛋白濃度需自行測(cè)定。由于提取液中含有一定濃度的蛋白（約1mg/mL），所以在測(cè)定樣本蛋白濃度時(shí)需要減去提取液本身的蛋白含量。

3. ΔA對(duì)照或ΔA測(cè)定出現(xiàn)負(fù)值為正常現(xiàn)象。

4. 推薦使用樣本蛋白濃度計(jì)算酶活，若用樣本質(zhì)量計(jì)算，則需加測(cè)胞漿提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方為總酶活。

5. 本試劑盒試劑足夠完成100管反應(yīng)。

6. 附:按樣本重量計(jì)算公式：（樣本檢測(cè)數(shù)為100T/24S）

（1）按微量石英比色皿計(jì)算
A、上清中TH-2活力的計(jì)算
單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生1 nmol APADH定義為一個(gè)酶活性單位。
TH-2（U/g 質(zhì)量）=[ΔA1×V反總÷（ε×d）]÷(W÷V提取×V樣) ÷T=498×ΔA1÷W
ΔA1：上清測(cè)定值；V反總：反應(yīng)體系體積，0.2mL；ε：APADH的消光系數(shù)，6.7×10^-3mL/nmol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V提?。杭尤胩崛∫后w積，1.0mL；V樣：樣本體積，0.02mL； T：反應(yīng)時(shí)間，3min。
B、沉淀中TH-2活力的計(jì)算
單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生1 nmol APADH定義為一個(gè)酶活性單位。
TH-2（U/g 質(zhì)量）=[ΔA2×V反總÷（ε×d）]÷(W÷V提取×V樣) ÷T=398×ΔA1÷W
ΔA2：沉淀測(cè)定值；V反總：反應(yīng)體系體積，0.2mL；ε：APADH的消光系數(shù)，6.7×10^-3mL/nmol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V提取：復(fù)溶沉淀的提取液體積，0.8mL；V樣：樣本體積，0.02mL；T：反應(yīng)時(shí)間，3min。

C、樣本TH-2總活力的計(jì)算
樣本TH-2總活力即為上清中TH-2活力與沉淀中TH-2活力之和。
按樣本質(zhì)量計(jì)算：TH-2（U/g 質(zhì)量）=498×ΔA1÷W+398×ΔA2÷W
（2）按96孔UV計(jì)算
將計(jì)算公式中的d-1cm換為d-0.6cm（96孔UV板光徑）進(jìn)行計(jì)算即可。
參考文獻(xiàn)：

1. Vandock K P, Drummond C A, Smith S L, et al. Midgut and fatbody mitochondrial transhydrogenase activities during larval-pupal development of the tobacco hornworm, Manduca sexta[J]. Journal of insect physiology, 2010, 56(7): 774-779.

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