可溶性淀粉合成酶(SSS)活性檢測試劑盒

可溶性淀粉合成酶（SSS）活性檢測試劑盒說明書
紫外分光光度法
注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。
貨號：BC1850
規(guī)格：25T/24S
產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二：臨用前取1瓶試劑二A加入8mL試劑一，緩慢加熱，逐漸升溫使其溶解，冷卻后加入試劑二B和試劑二C混合溶解，這樣可以分兩批配制并且測定，用不完的試劑-20℃分裝保存2周，避免反復(fù)凍融。

2. 試劑三：臨用前試劑三B加入試劑三A溶解備用，用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融。

3. 試劑四：臨用前先離心，取7 μL試劑四加入2.24 mL溶解好的試劑三混合備用（約14T），現(xiàn)用現(xiàn)配，也可根據(jù)樣本量按比例配制。

4. 試劑五：臨用前取試劑五B和試劑五C加入試劑五A溶解備用，用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融。

5. 試劑六：臨用前取1支加入208 μL蒸餾水充分溶解，用不完的試劑-20℃分裝保存2周，避免反復(fù)凍融。

6. 試劑七：臨用前加入2mL蒸餾水，用不完的試劑-20℃分裝保存8周，避免反復(fù)凍融。

產(chǎn)品說明：
SSS（EC 2.4.1.21）通常以游離態(tài)存在于質(zhì)體基質(zhì)中，催化淀粉鏈延長，主要負(fù)責(zé)支鏈淀粉的合成。
SSS催化ADPG與淀粉引物（葡聚糖）反應(yīng)，將葡萄糖分子轉(zhuǎn)移到淀粉引物上，同時生成ADP，在反應(yīng)體系中添加的丙 酮酸激酶、己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化NADP⁺還原為NADPH，NADPH生成量與前一步反應(yīng)中ADP生成量呈正比，340nm下測定NADPH增加量即可計算SSS活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計、水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液槍、1mL石英比色皿、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）
粗酶液制備：稱取約0.1g組織加入1mL提取液，冰浴中勻漿。10000g，4℃離心10分鐘，取上清，置冰上待測。
二、測定步驟

1. 紫外分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 樣本測定：在EP管內(nèi)按順序加入

混勻后立即在340nm波長下記錄初始吸光度A₁和2min后的吸光度A₂，計算ΔA=A₂-A₁。
注意：試劑二如有沉淀，加入之前要使之充分溶解混勻。
三、SSS活性計算
1、按樣本蛋白濃度計算：
單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個酶活力單位。
SSS活性（U/mg prot）=[ΔA÷（ε×d）×V測]÷(Cpr×V樣本÷V反總×V上清) ÷T=43.2×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定粗酶液蛋白質(zhì)濃度。
2、按照樣本質(zhì)量計算：
單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個酶活力單位。
SSS活性（U/g 質(zhì)量）=[ΔA÷（ε×d）×V測]÷(W÷V提取×V樣本÷V反總×V上清) ÷T=43.2×ΔA÷W
V測：測量體積，0.78mL；V反總：反應(yīng)體積，0.62mL；V提?。杭尤胩崛∫后w積，1mL；T：反應(yīng)時間，20min；ε：NADPH消光系數(shù)，6.22×10^-3mL/(nmol_˙cm)；d：石英比色皿光徑，1cm；V樣本：加入樣本的量，0.2mL；V上清：吸取上清液的量，0.45mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。
實驗實例：

1. 取約0.1g肝臟加入1mL提取液，冰浴中勻漿。10000g，4℃離心10分鐘，取上清置冰上待測。之后按照測定步驟操作，測得計算ΔA=A₂-A₁=0.394-0.211=0.183，按樣本質(zhì)量計算酶活得：SSS活性（U/g 質(zhì)量）=43.2×ΔA÷W=79.056 U/g 質(zhì)量。

2. 取約0.1g冬青加入1mL提取液，冰浴中勻漿。10000g，4℃離心10分鐘，取上清置冰上待測。之后按照測定步驟操作，測得計算ΔA=A₂-A₁=1.31-1.303=0.007，按樣本質(zhì)量計算酶活得：SSS活性（U/g 質(zhì)量）=43.2×ΔA÷W=3.024 U/g 質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)：

1. Jiang H, Dian W, Wu P. Effect of high temperature on fine structure of amylopectin in rice endosperm by reducing the activity of the starch branching enzyme[J]. Phytochemistry, 2003, 63(1): 53-59.

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