PCR純化Kit

PCR純化Kit
貨號(hào)：D6492-01
規(guī)格：100/盒
品牌：omega

     聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)是80年代中期發(fā)展起來(lái)的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)；能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增十萬(wàn)乃百萬(wàn)倍，使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚一個(gè)細(xì)胞中擴(kuò)增出足量的DNA供分析研究和檢測(cè)鑒定。過(guò)去幾天幾星期才能做到的事情，用PCR幾小時(shí)便可完成。PCR技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一項(xiàng)革命性創(chuàng)舉和里程碑。

    PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性→退火→延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱94℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。重復(fù)循環(huán)變性→退火→延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需 2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。

PCR反應(yīng)體系：
    1、引物：引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。引物濃度一般為0.1～0.5μM，這一引物濃度足以使1kb的DNA片段在PCR反應(yīng)體系中循環(huán)擴(kuò)增30T。以低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)，但濃度過(guò)低則得不到產(chǎn)物或產(chǎn)量過(guò)低。

    2、Taq酶：目前有兩種Taq DNA聚合酶供應(yīng)， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，但保真度較差，在復(fù)制比較長(zhǎng)的模板時(shí)容易發(fā)生點(diǎn)突變。另一種為在大腸桿菌合成的基因工程酶。能催化以DNA單鏈為模板，以堿基互補(bǔ)原則為基礎(chǔ)，按5’→3’方向逐個(gè)將dNTP分子連接到引物的3’端，合成一條與模板DNA互補(bǔ)的新的DNA子鏈。無(wú)3’→5’的外切酶活性，沒(méi)有校正功能。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶用量一般為0.5～5U/100μl，濃度過(guò)高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過(guò)低則合成產(chǎn)物量減少。

    3、dNTP：dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系。多次凍融會(huì)使dNTP降解，一般存儲(chǔ)濃度為10mM，小量分裝，-20℃冷凍保存。在PCR反應(yīng)中，dNTP濃度一般為50～200μM，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)(偏高或偏低)，就會(huì)引起錯(cuò)配。高濃度dNTP可加速反應(yīng)，但同時(shí)會(huì)增加錯(cuò)誤摻入和實(shí)驗(yàn)成本；低濃度dNTP可提高PCR的性，但反應(yīng)速度和PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量會(huì)降低。dNTP能與Mg 2+ 結(jié)合，使游離的Mg 2+ 濃度降低。

    4、模板：就模板而言，影響PCR的主要指模板的數(shù)量和純度。一般PCR反應(yīng)中模板的數(shù)量為10 2 ～10 5 個(gè)拷貝，靈敏的PCR甚可從一個(gè)細(xì)胞、一根頭發(fā)、一個(gè)孢子或一個(gè)精子提取的DNA中分析目的序列。模板的純度一般要求不是很高，某些擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中甚將裂解液直接作為PCR模板。但模板中不能有影響擴(kuò)增反應(yīng)的物質(zhì)存在，如蛋白酶、核酸酶、尿素、SDS、EDTA、卟啉類物質(zhì)等，上述物質(zhì)的存在會(huì)影響擴(kuò)增效果，甚使擴(kuò)增失敗。模板DNA的量不能太高，否則擴(kuò)增可能不會(huì)成功，在此情況下可適當(dāng)稀釋模板。一般對(duì)于單拷貝的哺乳動(dòng)物基因組模板來(lái)說(shuō)，100ul的反應(yīng)體系中有100ng的模板已足夠。

    5、Mg 2+ ：Mg 2+ 濃度對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響。一般PCR反應(yīng)中，當(dāng)dNTP濃度為200μM時(shí)，Mg 2+ 濃度為1.5～2.0mM為宜。Mg 2+ 濃度過(guò)高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，Mg 2+ 濃度過(guò)低會(huì)降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。此外，Mg 2+濃度還影響引物的退火、模板與PCR產(chǎn)物的解鏈溫度、產(chǎn)物的特異性、引物二聚體的生成等。

PCR反應(yīng)條件：
    1、變性溫度與時(shí)間：變性溫度低，解鏈不*是導(dǎo)致PCR失敗的主要原因。一般情況下，93℃～94℃/min足以使模板DNA變性，若低于93℃則 需延長(zhǎng)時(shí)間，但溫度不能過(guò)高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對(duì)酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物*變性，就會(huì)導(dǎo)致PCR失敗。
    2、退火溫度與時(shí)間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA 比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長(zhǎng)度。對(duì)于20個(gè)核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇適退火溫度的起點(diǎn)較為理想。引物的復(fù)性溫度可通過(guò)以下公式幫助選擇合適的溫度：

Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)
   復(fù)性溫度=Tm值－(5～10℃)
   在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時(shí)間一般為30～60秒，足以使引物與模板之間*結(jié)合。
    3、延伸溫度與時(shí)間：PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過(guò)高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。PCR延伸反應(yīng)的時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定，一般1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時(shí)間1min是足夠的。3～4kb的靶序列需3～4min；擴(kuò)增10Kb需延伸15min。延伸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時(shí)間要稍長(zhǎng)些。
    4、循環(huán)次數(shù)：循環(huán)次數(shù)決定PCR擴(kuò)增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在30～40T之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。

PCR純化Kit訂購(gòu)說(shuō)明：

1、絕大部分產(chǎn)品備有現(xiàn)貨，一般情況下都能訂貨當(dāng)日發(fā)貨。 
2、部分非常用產(chǎn)品，需提前1－2日預(yù)訂，海外期貨則需要提前3-6周預(yù)訂。 
3、部分產(chǎn)品價(jià)格會(huì)因貨期、批次等因素發(fā)生變化，若有變動(dòng)以訂貨當(dāng)日新價(jià)格為準(zhǔn)。 
4、每日訂單截止時(shí)間為16點(diǎn)整，部分城市可到17點(diǎn)整，因超過(guò)截止時(shí)間造成當(dāng)日不能發(fā)貨的將于次日安排發(fā)貨。
5、請(qǐng)辦理完貨款后，將收據(jù)、底單等連同收貨人的地址、姓名、等以傳真、、短信、等形式通知我們。

運(yùn)輸說(shuō)明：

1、極低溫產(chǎn)品：極低溫產(chǎn)品運(yùn)輸過(guò)程中加裝干冰運(yùn)輸。用干冰把產(chǎn)品包裹起來(lái)，再用泡沫盒密封，膠帶層層粘住泡沫盒，放入索萊寶的箱子，然后交付給合作快遞，安全快速高效放心的送客戶的手中，保證產(chǎn)品的性質(zhì)穩(wěn)定如一，為您的實(shí)驗(yàn)保駕護(hù)航。
2、低溫產(chǎn)品：低溫產(chǎn)品運(yùn)輸過(guò)程中加裝索萊寶冰袋運(yùn)輸。事先用冰袋把產(chǎn)品包裹起來(lái)，再使用泡沫盒密封，用膠帶嚴(yán)實(shí)密封泡沫盒，再放入索萊寶的箱子（保溫效果少可以持續(xù)一周），然后交付給合作快遞，安全快速高效放心的送客戶的手中，保證產(chǎn)品的性質(zhì)穩(wěn)定如一，為您的實(shí)驗(yàn)保駕護(hù)航。
3、常溫產(chǎn)品：常溫產(chǎn)品運(yùn)輸過(guò)程中無(wú)需加冰或者特殊包裝。產(chǎn)品由公司庫(kù)房人員快速配貨，準(zhǔn)確快速高效的快遞保證產(chǎn)品快速送達(dá)您的手中。