檸檬酸合酶（CS）活性檢測試劑盒 微量法

檸檬酸合酶
（CS）活性檢測試劑盒說明書
微量法
貨號：BC1065
規(guī)格：100T/48S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑五：臨用前加入500 μL雙蒸水，用不完的試劑仍-20℃保存；

2. 試劑六：臨用前加入1.5 mL雙蒸水，用不完的試劑仍-20℃保存。

產品說明：
CS（EC 2.3.3.1）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞的線粒體基質中，是三羧酸循環(huán)第一個限速酶，是三羧酸循環(huán)主要調控位點之一。
CS催化乙酰CoA和草酰乙酸產生檸檬酰輔*A，進一步水解產生檸檬酸；該反應促使DTNB轉變成黃色的TNB，在412nm處有特征吸光值。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計/酶標儀、低溫離心機、水浴鍋、研缽/勻漿器、可調節(jié)移液器、微量玻璃比色皿/96孔板和蒸餾水。
操作步驟：具體操作步驟詳見“產品資料"附件

注意事項：
1、測定過程中樣本和所有試劑在冰上放置，以免變性和失活。
2、比色皿中反應液的溫度必須保持37℃或25℃，取小燒杯一只裝入一定量的37℃或25℃蒸餾水，將此燒杯放入37℃或25℃水浴鍋中。在反應過程中把比色皿連同反應液放在此燒杯中。
3、最好兩個人同時做此實驗，一個人比色，一個人計時，以保證實驗結果的準確性。
4、用96孔板測定時，根據測定管數量配制測定管工作液（試劑三、四、五、六）和對照管工作液（試劑三、四），因通過單位時間內吸光值變化計算酶活，不推薦同時測多個樣本。
5、推薦使用樣本蛋白濃度計算酶活，若用樣本質量計算，則需加測胞漿提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方為總酶活。
6、附：使用樣本鮮重計算公式：
A、按微量玻璃比色皿計算
單位的定義：37℃或25℃下每g組織在反應體系中每分鐘催化產生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位。
CS上清（U/g 質量）=ΔA上清÷（ε×d）×V反總÷（W×V樣本÷V提取）÷T=1061×ΔA上清÷W
CS沉淀（U/g 質量）=ΔA沉淀÷（ε×d）×V反總÷（W×V樣本÷V樣總）÷T=212×ΔA沉淀÷W
CS（U/g 質量）=CS上清+CS沉淀=1061×ΔA上清÷W+212×ΔA沉淀÷W
ΔA上清：上清測定值；ΔA沉淀：沉淀測定值；ε：TNB的消光系數，13.6×10^-3mL/(nmol·cm)；V反總：反應體系總體積，0.2 mL；d：比色皿光徑，1cm；V樣本：加入的樣本體積，0.007mL；V提?。禾崛∫后w積，1.01mL；V樣總：溶解沉淀的總體積，0.202mL；T：反應時間，2min；W：樣本質量，g。
B、按96孔板計算
將上述公式中的d=1cm改為d=0.6cm（96孔板光徑）進行計算即可。
實驗實例：

1. 取0.1g小鼠心臟樣本加入1mL提取液和10μL試劑二進行勻漿研磨，取上清后再離心，取上清，取沉淀后加入200μL試劑一和2μL試劑二，之后按照測定步驟操作，用微量石英比色皿測吸光度后計算上清中：ΔA1=A2-A1 =1.4577-0.8015=0.6562，ΔA1’=A2’-A1’=0.7842-0.7331=0.0511，ΔA上清=ΔA1-ΔA1’=0.6051；沉淀中：ΔA1= A2 -A1 =0.4166-0.1303=0.2863，ΔA1’=A2’-A1’=0，ΔA沉淀=ΔA1-ΔA1’=0.2863，按樣本質量計算酶活得：CS（U/g 質量）= CS上清+CS沉淀=1061×ΔA上清÷W+212×ΔA沉淀÷W

= 1061×0.6051÷0.1+212×0.2863÷0.1=7027.067 U/g 質量。
相關發(fā)表文獻：

1. Ming Song,Fangfang Chen,Yihui Li,et al. Trimetazidine restores the positive adaptation to exercise training by mitigating statin-induced skeletal muscle injury. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. November 2017;(IF10.754)

2. Zhang J, Lv J, Xie J, et al. Nitrogen Source Affects the Composition of Metabolites in Pepper (Capsicum annuum L.) and Regulates the Synthesis of Capsaicinoids through the GOGAT–GS Pathway[J]. Foods, 2020, 9(2): 150.

參考文獻：
[1]  Agostinho F R, Réus G Z, Stringari R B, et al. Treatment with olanzapine, fluoxetine and olanzapine/fluoxetine alters citrate synthase activity in rat brain[J]. Neuroscience letters, 2011, 487(3): 278-281.
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