線粒體異檸檬酸脫氫酶測(cè)試盒 三羧酸循環(huán)

線粒體異檸檬酸脫氫酶（ICDHm）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)
可見(jiàn)分光光度法
貨號(hào)：BC2160
規(guī)格：50T/24S
產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 提取液二：易揮發(fā)試劑，用完后蓋緊蓋兒后及時(shí)放回-20℃保存；

2. 試劑三：臨用前加入0.75 mL蒸餾水，充分溶解待用，用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融；

3. 標(biāo)準(zhǔn)品：10 mg α-酮戊二酸。臨用前加入684 μL蒸餾水，配成100 μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)液，2-8℃保存8周；

4. 工作液的配制：臨用前根據(jù)用量將試劑一、試劑二按1:1比例混合，現(xiàn)配現(xiàn)用。

產(chǎn)品說(shuō)明：
線粒體異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，ICDHm），廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中，與線粒體基因表達(dá)及線粒體其他的功能有關(guān)。異檸檬酸脫氫酶在生物體內(nèi)有兩種存在形式，以NAD為輔酶的NAD-依賴型異檸檬酸脫氫酶，和以NADP為輔酶的NADP-依賴型異檸檬酸脫氫酶。
異檸檬酸脫氫酶的主要功能，是在體內(nèi)三羧酸循環(huán)中，催化異檸檬酸生成α-酮戊二酸，將NAD還原成NADH，通過(guò)測(cè)定α-酮戊二酸的生成量，可以計(jì)算出線粒體異檸檬酸脫氫酶活力高低。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。
需自備的儀器和用品：
低溫離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、1mL玻璃比色皿、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟：具體操作步驟詳見(jiàn)“產(chǎn)品資料"附件
注意事項(xiàng)：

1. 為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，需先取1-2個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn)，如果測(cè)定的吸光值過(guò)高（高于1），可用提取液三稀釋

上清液后再測(cè)定。計(jì)算結(jié)果時(shí)注意乘以稀釋倍數(shù)。

1. 推薦使用樣本蛋白濃度計(jì)算酶活，若用樣本質(zhì)量計(jì)算，則需加測(cè)胞漿提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方為總酶活。

2. 測(cè)定蛋白濃度時(shí)，由于試劑一本身含有蛋白（約1mg/mL），所以測(cè)定時(shí)需扣除此部分蛋白。

3. 附：使用樣本重量計(jì)算公式

A、上清（胞漿）中ICDHm活力計(jì)算：
按樣本質(zhì)量計(jì)算
酶活定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生1 nmol α-酮戊二酸定義為一個(gè)酶活性單位。
ICDHm活性（U/g 質(zhì)量）=x×V樣÷(W×V樣÷V提取)÷T×10³=25.25×x÷W
V提取：加入提取液體積，1.515mL；V樣：加入上清液體積，0.2mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，1h=60min；10³：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1μmol =10³nmol。
B、沉淀（線粒體）中ICDHm活力計(jì)算：
按樣本質(zhì)量計(jì)算
酶活定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生1 nmol α-酮戊二酸定義為一個(gè)酶活性單位。
ICDHm活性（U/g 質(zhì)量）=x×V樣÷(W×V樣÷V提取)÷T×10³=10.1×x÷W
V提?。撼恋碇貞視r(shí)加入提取液體積，0.606mL；V樣：加入上清液體積，0.2mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，1h=60min；10³：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1μmol =10³nmol。
C、樣本ICDHm總活力計(jì)算：
樣本ICDHm總活力即為上清（胞漿）中ICDHm活力與沉淀（線粒體）中ICDHm活力之和。
按樣本質(zhì)量計(jì)算：ICDHm（U/g 質(zhì)量）=25.25×x÷W+10.1×x÷W
實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 取0.3g小鼠腎臟加入1.5mL提取液一和15μL提取液二，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。4℃，1000g離心10min。將上清液移至另一離心管中，4℃，11000g離心15min。上清液即胞漿提取物，在沉淀中加入600μL提取液三和6μL提取液二，超聲波破碎，4℃，10000g離心10min，取上清液，分別按操作步驟檢測(cè)，測(cè)得：胞漿ΔA測(cè)定=A測(cè)定管-A對(duì)照管=0，線粒體ΔA測(cè)定=A測(cè)定管-A對(duì)照管=0.767-0.475=0.292，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=1.0917x+0.0471計(jì)算相應(yīng)的x值，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

胞漿中ICDHm活性（U/g質(zhì)量）=25.25×x÷W=0 U/g質(zhì)量
線粒體中ICDHm活性（U/g質(zhì)量）=10.1×x÷W=7.55 U/g質(zhì)量
樣本總ICDHm（U/g 質(zhì)量）=25.25×x÷W+10.1×x÷W=7.55 U/g質(zhì)量。
 

1. 取0.3g小化眉加入1.5mL提取液一和15μL提取液二，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。4℃，1000g離心10min。將上清液移至另一離心管中，4℃，11000g離心15min。上清液即胞漿提取物，上清液稀釋2倍，在沉淀中加入600μL提取液三和6μL提取液二，超聲波破碎，4℃，10000g離心10min，取上清液稀釋2倍，分別按操作步驟檢測(cè)，測(cè)得：胞漿ΔA測(cè)定=A測(cè)定管-A對(duì)照管=0，線粒體ΔA測(cè)定=A測(cè)定管-A對(duì)照管=0.635-0.487=0.148，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=1.0917x+0.0471計(jì)算相應(yīng)的x值，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

胞漿中ICDHm活性（U/g質(zhì)量）=25.25×x÷W×2=15.49U/g質(zhì)量
線粒體中ICDHm活性（U/g質(zhì)量）=10.1×x÷W×2=2.28 U/g質(zhì)量
樣本總ICDHm（U/g 質(zhì)量）=25.25×x÷W×2+10.1×x÷W×2=15.49 U/g質(zhì)量。
相關(guān)發(fā)表文獻(xiàn)：
Xiao Li, Qi Zhao, Jianni Qi, et al. lncRNA Ftx promotes aerobic glycolysis and tumor progression through the PPARγ pathway in hepatocellular carcinoma. International Journal of Oncology. May 2018;(IF3.571)
參考文獻(xiàn)：
Igamberdiev A U, Gardestr?m P. Regulation of NAD-and NADP-dependent isocitrate dehydrogenases by reduction levels of pyridine nucleotides in mitochondria and cytosol of pea leaves[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Bioenergetics, 2003, 1606(1-3): 117-125.
相關(guān)系列產(chǎn)品：
BC0710/BC0715  α-酮戊二酸脫氫酶（α-KGDH）活性檢測(cè)試劑盒
BC0950/BC0955  琥珀酸脫氫酶（SDH）活性檢測(cè)試劑盒
BC0380/BC0385  *酸脫氫酶（PDH）活性檢測(cè)試劑盒

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