微生物及液體S本中甲醛脫氫酶活性盒輔酶

微生物及液體樣本中甲醛脫氫酶（FDH）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書

紫外分光光度法

貨號(hào)：BC4990

規(guī)格：50T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：臨用前取1支加入0.25 mL蒸餾水，震蕩溶解；用不完的試劑-20℃分裝保存2周。

2、 試劑二工作液：根據(jù)試驗(yàn)所需用量，按照試劑二（μL）∶蒸餾水（μL）=1∶29比例配成工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。試劑二工作液當(dāng)天配制當(dāng)天用完。

3、 試劑三：臨用前取1支加入1.5 mL蒸餾水，震蕩使其充分溶解。用不完的試劑4℃分裝保存2周。

產(chǎn)品說(shuō)明：

甲醛脫氫酶存在于絕大多數(shù)原核生物以及所有的真核生物中，是一種將甲醛進(jìn)行轉(zhuǎn)換的氧化還原酶。甲醛脫氫酶催化甲醛和 NAD⁺產(chǎn)生 NADH，在 340nm 處的吸光值會(huì)增加，測(cè)定340nm處的吸光值變化，可計(jì)算得到甲醛脫氫酶的活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、1 mL石英比色皿、低溫離心機(jī)、恒溫水浴鍋/培養(yǎng)箱、可調(diào)式移液槍、超聲波細(xì)胞破碎儀、蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照每500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1 mL提取液，超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3s，間隔9s，總時(shí)間 3 min）；然后8000 g，4℃，離心10 min，取上清（若上清不夠澄清，建議重復(fù)上述離心步驟），置于冰上待測(cè)。

血清及液體樣本：直接檢測(cè)，若液體不澄清，可以離心后取上清測(cè)定。

二、測(cè)定步驟

1、 紫外分光光度計(jì)預(yù)熱30 min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340 nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 臨用前將試劑一置于37℃預(yù)熱20 min。

3、在1 mL石英比色皿中依次加入 100 μL 樣本、550 μL試劑一、250 μL試劑二工作液、50 μL試劑三、50 μL試

劑四，立即充分混勻后于340nm處測(cè)定20s時(shí)的吸光值A1，迅速置于37℃水浴鍋或者培養(yǎng)箱中反應(yīng)5min，拿出迅速擦干測(cè)定5min20s時(shí)的吸光值A2，記錄 340nm 下20s時(shí)吸光值 A1 和 5min 后的吸光值 A2。計(jì)算ΔA=A2-A1。

三、酶活性計(jì)算

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞中FDH活力的計(jì)算

（1）按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：

單位的定義：每10⁴個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化1 nmol NAD⁺生成1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

FDH酶活（U/10⁴ cell）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷（V樣÷V樣總×N）÷T×F =ΔA×321.54÷N×F

（2）按蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化1 nmol NAD⁺生成1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

FDH酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷（V樣×Cpr）÷T×F=321.54×ΔA÷Cpr×F

2、血清（漿）或液體樣本FDH活力的計(jì)算

（1）按液體體積計(jì)算：

單位的定義：每mL液體樣本中每分鐘催化1 nmol NAD⁺生成1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

FDH酶活（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷V樣÷T×F =ΔA×321.54×F

（2）按蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化生成1 nmol NAD⁺生成1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

FDH酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷（V樣×Cpr）÷T×F=321.54×ΔA÷Cpr×F

e：NADH 摩爾消光系數(shù)，6220 L/mol/cm；d：石英比色皿光徑，1cm；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；V反總：酶促反應(yīng)總體積，0.001L；V樣總：加入提取液體積，1 mL；V樣：加入樣本體積，0.1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；N：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，以萬(wàn)計(jì)；F：稀釋倍數(shù)；10⁹：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1mol=10⁹ nmol。

注意事項(xiàng)：

1、如果測(cè)定吸光值A＞1.5或ΔA＞0.5，建議稀釋樣本后再測(cè)定，計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)；如果測(cè)定吸光值較低，建議增加樣本量后再進(jìn)行測(cè)定。

2、試劑四有毒性，實(shí)驗(yàn)時(shí)請(qǐng)佩戴口罩手套等防護(hù)措施。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 取0.1g大腸桿菌沉淀加入1 mL提取液，超聲波破碎細(xì)胞（功率300W，超聲3s，間隔9s，總時(shí)間 3min）；然后8000 g，4℃，離心10 min，取上清按照測(cè)定步驟操作，測(cè)定后計(jì)算ΔA =A2-A1=0.297-0.039=0.258，按細(xì)菌數(shù)量計(jì)算酶活得：

FDH酶活（U/g 質(zhì)量）= 321.54×ΔA÷W×F =829.57 U/g。

2、 取0.1 mL牛血清按照測(cè)定步驟操作，測(cè)定后計(jì)算ΔA=A2 -A1=0.124-0.087=0.037，按液體體積計(jì)算酶活得：

FDH酶活（U/mL）=ΔA×321.54=11.896 U/mL。

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